猪脾脏多肽的酶法制备及其生物活性研究

目的探索酶解法制备猪脾脏多肽的最佳条件,检测所得产物的生物活性。方法用胰酶酶解法、正交试验、甲醛滴定法考察最佳酶解条件,用乙醇沉淀法收集多肽,并分别用Fe2+诱发卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化体系和纤维蛋白平板法检测多肽的抗氧化活性和溶栓活性,CM-Sepharose离子交换层析纯化最佳酶解条件下的脾多肽,利用SDS-PAGE电泳确定具备促凝活性的多肽分子片段相对分子质量。结果最佳酶解条件为60℃,pH 7.0,加酶量6.0%,时间5.5 h;检测到脾多肽具备抗氧化活性和促凝活性,经纯化后的脾多肽促凝时间比正常对照提前20 s。结论可初步判断猪脾脏多肽在抗氧化和凝血方面有一定作用,且首次证实猪脾多肽具有凝血功能。

人胎盘蜕膜基层来源MSCs参与裸鼠皮肤创面修复的研究

目的探讨人胎盘蜕膜基层来源MSCs（placental decidua basalis derived MSCs, PDB-MSCs）参与裸鼠全层皮肤缺损修复的效果。方法取自愿捐赠人胎盘组织，采用酶消化法结合密度梯度离心法分离培养PDB—MSCs并传代，取第4代细胞进行实验。倒置相差显微镜观察细胞形态，行成骨与成脂诱导鉴定，检测细胞表面特异性抗原表达以鉴定细胞。取42只4—5周龄雌性BALB／c裸鼠，随机分为两组（n=21）；分别将200gL浓度为5〉（106个／mL的第4代PDB—MSCs及等体积PBS经尾静脉注射入实验组及对照组裸鼠体内；注射后3d实验动物于背部制备大小为1．5cmxl．5cm全层皮肤缺损模型。术后1、2、4、7、14、18、21、25、30d大体观察创面愈合情况，待创面开始脱痂后测量创面愈合率。术后1、7、14、21、30d取材行HE染色，观察创面修复情况；7、14、30d实验组采用免疫荧光染色法行细胞定位分析。结果经鉴定胎盘蜕膜组织所分离的细胞为MSCs，具有多向分化能力和MSCs免疫组织表型。术后两组裸鼠存活至实验完成。大体观察示，实验组创面愈合较对照组快，其中实验组于术后12—14d、对照组于14—17d开始脱痂。实验组术后14、18、21d创面愈合率均显著高于对照组（t=4．001，P=0．016；t=3．380，P=0．028；t=3．888，P=0．018）；25、30d两组比较差异无统计学意义（t=1．565，P=0．193；t=1．000，P=0．423）。组织学观察示，与对照组比较，实验组皮肤创面组织炎性反应低，并且随时间延长皮肤各层组织及腺体等再生良好。免疫荧光染色示，术后各时间点实验组皮肤创面区域均可见人线粒体抗原染色阳性，提示存在人源细胞。结论通过酶消化法结合密度梯度离心法可稳定获得PDB．MSCs，预先注射人裸鼠体内后，在皮肤损伤条件下细胞可向皮肤损伤部位迁移，并促进创面修复。

大鼠BMSCs自发钙化过程中成骨相关基因表达谱的分析

目的分析大鼠BMSCs自发钙化过程中成骨相关基因表达谱的改变。方法取健康3日龄SD大鼠骨髓分离培养BMSCs并扩增至第4代,体外构建自发钙化模型。于培养7、14 d,倒置相差显微镜观察细胞生长状况及自发钙化进程,并行茜素红染色观察。分别于培养0、7、14 d时收集细胞进行基因芯片分析,并对差异表达基因进行生物信息学分析。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)验证芯片分析结果。结果大鼠BMSCs在体外发生了自发钙化,并于培养7 d后细胞开始堆集,茜素红染色为弱阳性;培养14 d后细胞堆积明显并形成典型的茜素红染色阳性钙结节样结构。自发钙化过程中共检测到576个差异表达的基因探针,对应378个大鼠基因。其中0 d和7 d相比有359个差异表达的基因探针,而7 d和14 d相比只有13个差异表达的基因探针。差异表达基因依据表达模式不同可分为6类;依据生物学功能亲和关系,与骨细胞生物学密切关联的差异表达基因又可分为7大类,即血管生成、细胞凋亡、骨相关基因、细胞周期、发育、细胞通讯和成骨信号通路。基因功能关联性分析显示有12个在功能上联系密切的细胞周期类基因在自发钙化过程中发生了下调;此外,基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,Mmp13)、分泌型磷酸蛋白1(secreted phosphoprotein 1,Spp1)、Cxcl12、Mmp2、Mmp3、Apoe和Itga7与较多的差异表达基因存在功能上的联系。Spp1、Mgp、Mmp13、Wnt抑制因子1、Cxcl12和细胞周期素A2的RT-qPCR验证结果与基因芯片结果一致。结论细胞接种后的前7 d是决定大鼠BMSCs自发钙化的关键期。BMSCs自发钙化过程受细胞通讯类基因、骨相关基因、细胞周期类基因、TGF-β信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路和Wnt信号通路等多方面的共同调控。