SOX7基因慢病毒载体的构建及其在缺氧条件下对HUVECs增殖与迁移功能的影响

目的构建过表达SRY-box transcription factor 7(SOX7)基因的慢病毒载体,建立SOX7基因过表达的人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并在常氧和缺氧条件下探究过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。方法使用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术扩增SOX7基因,通过同源重组法构建以pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen为载体的SOX7-pHAGE重组质粒。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)和免疫印迹(Western blot)法检测目的基因的mRNA和蛋白表达。将SOX7-pHAGE重组质粒和包装质粒共转染293T细胞,获得含有SOX7-pHAGE慢病毒悬液,经浓缩后感染HUVECs,构建SOX7稳定感染细胞株。应用qPCR和Western blot技术检测SOX7基因的mRNA和蛋白的表达。在常氧及缺氧条件下,通过细胞划痕实验和CCK-8法检测过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。结果SOX7-pHAGE重组质粒经测序后,序列比对正确。qPCR和Western blot法成功检测出SOX7-pHAGE重组质粒转染的293T细胞在mRNA水平过表达约111.4倍(P=0.0028),在蛋白质水平上出现过表达条带;qPCR和Western blot技术成功检测到SOX7-pHAGE慢病毒感染的HUVECs在mRNA水平上显著升高约68.2倍(P=0.0030),在蛋白水平上显著升高约1.7倍(P=0.0043),SOX7-pHAGE重组质粒及SOX7稳定感染细胞株构建成功。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的迁移能力没有发生改变(P>0.9999),而在缺氧条件下其迁移能力增强约1.2倍(P=0.0044)。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的增殖能力增强约1.3倍(P=0.0087),在缺氧条件下其增殖能力也显著增强约1.4倍(P=0.0228)。结论SOX7稳定感染细胞株可促进HUVECs的增殖能力。在缺氧条件下,SOX7稳定感染细胞株可回补HUVECs被抑制的迁移和增殖能力。

转录因子Fox家族与心肌梗死关系的研究进展

转录因子Fox家族在心肌梗死中发挥重要作用。FoxP1既调控巨噬细胞,加重炎症反应;也促进内皮细胞增殖,增加血管新生。FoxO3发挥抗氧化应激和调控自噬作用,同时促进心脏微血管内皮细胞凋亡或抑制心肌细胞凋亡。FoxO4和FoxO6促进心肌细胞凋亡和氧化应激。本文对Fox家族在心肌梗死中的作用及其分子机制作一综述,以期对心肌梗死的诊疗提供新方向。

完全性肺静脉异位引流潜在致病基因PDX1突变对其基因功能的影响

目的·采用全外显子测序技术筛查完全性肺静脉异位引流(total anomalous pulmonary venous connection,TAPVC)的可能致病基因,并对其功能进行验证。方法·选择2014—2019年在上海交通大学医学院附属新华医院及上海儿童医学中心确诊的100例TAPVC患儿(患儿组)以及120例健康儿童(对照组)为研究对象。收集2组儿童的血液样本,抽提全血基因组DNA并行外显子测序,以筛查TAPVC的潜在致病基因。通过Mutation Taster、SIFT、PolyPhen-2网站筛选致病基因的有害突变位点,并行Sanger测序。构建PDX1野生型(野生组)及突变型(突变组)质粒,转染入HUVEC细胞后,分别采用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)和蛋白质印迹法检测突变对PDX1的mRNA和蛋白水平的影响。采用STRING数据库进行蛋白与蛋白之间的相互作用分析,并采用qPCR研究PDX1调节的下游基因的表达。结果·在TAPVC患儿中发现致病基因为PDX1, Sanger测序显示该基因存在2个新发突变,即c.C237A(P33T)和c.C237G(P33A)。与野生组相比,2个突变组(CA组、CG组)的PDX1 mRNA水平没有显著变化,但蛋白相对表达量有明显增加,即分别是野生组的2.9倍和3.4倍(P=0.000,P=0.001)。蛋白质相互作用分析的结果显示,PDX1与SOX17相关联;且qPCR结果显示,PDX1过表达可下调HUVEC细胞中SOX17的表达。结论·PDX1的2个新发错义突变可影响其转录后翻译,且PDX1可能是通过调控SOX17来参与TAPVC的发生与发展。

血管结构异常的先天性心脏病患儿中Vav2基因突变的筛查和功能分析

目的通过全外显子组测序筛查血管结构异常类先天性心脏病(CHD)致病候选基因Vav2的新发突变c.701C>T:p.P234L,探究Vav2及其新发罕见突变对内皮细胞功能的影响,探索CHD发生的可能分子机制。方法分析117例血管结构异常类CHD患儿及200例正常儿童的外周血全外显子组测序数据筛查Vav2突变。构建Vav2野生型及突变型表达质粒,转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),通过qRT-PCR和Western blot检测Vav2、下游Rac1 mRNA和蛋白的表达水平;通过CCK-8、划痕试验和成管实验检测Vav2及突变对HUVEC增殖、迁移和成管能力的影响。结果在血管结构异常类CHD患儿中发现的Vav2罕见突变c.701C>T:p.P234L,在对照组中未出现且从未被报道。与野生型对比,P234L突变能降低Vav2蛋白表达,CCK-8、划痕试验和成管实验发现该突变影响Vav2促进HUVEC增殖、迁移和成管等血管生成相关的功能,但该突变不影响下游Rac1本底mRNA和蛋白表达。结论Vav2的错义突变影响Vav2蛋白表达,进而损害Vav2在HUVEC中促进增殖、迁移和成管等血管生成相关的功能,可能是影响下游Rac1激活而非本底表达导致的。Vav2是血管发育过程的关键分子,可能参与调控血管结构异常类CHD发生,P234L突变导致Vav2功能受损,进一步提供了Vav2在血管结构异常类CHD中可能的致病分子机制。

尺骨冠状突骨折合并肘关节后脱位有限元模型的建立与分析

目的:建立尺骨冠状突骨折合并肘关节后脱位的有限元模型,并对肘关节后脱位在关节稳定性方面的影响进行数字化研究。方法:建立正常肘关节-前臂(IEJF)有限元模型与尺骨冠状突骨折肘关节-前臂(FUCF)有限元模型。采用压缩、屈曲两组生理荷载(每组3种幅值),进行计算、验证和应力分析。结果:建立了结构完整的IEJF与FUCF有限元模型,并对模型进行验证,情况与临床实际符合。计算得出FUCF有限元模型较IEJF有限元模型桡骨头出现了严重的应力集中现象,不同压缩荷载作用下的肘关节纵向压缩位移与不同屈曲力矩导致的屈曲角都有所增加。结论:尺骨冠状突骨折及肘关节后脱位对肘关节-前臂纵向不稳有一定程度的影响。本研究所构建的肘关节-前臂有限元模型对尺骨冠状突骨折合并肘关节后脱位的临床稳定性评估研究及手术治疗方案的制定具有一定的参考价值。