为了研究睾丸发育特异性蛋白-27基因(testis development specific protein gene 27,NYD-SP27)基因对绵羊精子活率、畸形率及精子内cAMP信号通路中酶类表达量影响,分别将NYD-SP27基因的过表达载体、干扰载体质粒注射到绵羊的睾丸中,通...为了研究睾丸发育特异性蛋白-27基因(testis development specific protein gene 27,NYD-SP27)基因对绵羊精子活率、畸形率及精子内cAMP信号通路中酶类表达量影响,分别将NYD-SP27基因的过表达载体、干扰载体质粒注射到绵羊的睾丸中,通过电刺激采精法采集绵羊精液,对绵羊精子进行染色,检测其活率、畸形率,并通过ELISA方法检测精子中cAMP信号通路中相关酶类的表达量。结果显示:与对照组相比,过表达组精子活率变化不明显,而干扰组有较明显的升高,精子畸形率差异不明显;与过表达组、干扰组绵羊精子中环磷酸腺苷酸的表达量差异极显著(P<0.01);与过表达组绵羊精子中PKA的表达量差异不显著(P>0.05),而干扰组显著升高(P<0.05)。综上所述,干扰NYD-SP27基因对精子中环磷酸腺苷酸和PKA的表达具有调控作用,并对绵羊精子活率具有一定的提高效果。本研究为进一步研究NYD-SP27基因调控绵羊精子发生及获能的分子机制奠定基础。展开更多
文摘本研究旨在对绵羊NYD-SP 27基因进行克隆和原核表达,并对其表达的蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中绵羊NYD-SP 27基因序列(登录号:KX905090)设计1对特异性引物,通过PCR方法扩增目的基因片段,构建pET-22b(+)-NYDSP27重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提质粒进行双酶切鉴定,将鉴定正确的pET-22b(+)-NYDSP27重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并利用生物信息学方法对NYD-SP 27基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,试验成功扩增出大小为1617 bp的NYD-SP 27基因片段,并经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切获得大小为5400和1617 bp的两条片段,表明成功构建了pET-22b(+)-NYDSP27重组质粒,诱导表达重组蛋白大小约60 ku,主要以包涵体的形式存在。NYD-SP27蛋白分子式为C 2798 H 4319 N 737 O 819 S 19,原子总数为6892,理论等电点(pI)为6.16,为酸性蛋白,不稳定系数为46.96,属于不稳定蛋白,总平均亲水性为-0.403。该蛋白无跨膜结构,无信号肽,含有45个潜在的磷酸化位点和24个抗原表位;NYD-SP27蛋白二级结构中的α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占26.21%、3.90%、18.03%和51.86%。本试验结果可为深入研究绵羊NYD-SP27蛋白的作用机理提供理论依据。
文摘为了研究睾丸发育特异性蛋白-27基因(testis development specific protein gene 27,NYD-SP27)基因对绵羊精子活率、畸形率及精子内cAMP信号通路中酶类表达量影响,分别将NYD-SP27基因的过表达载体、干扰载体质粒注射到绵羊的睾丸中,通过电刺激采精法采集绵羊精液,对绵羊精子进行染色,检测其活率、畸形率,并通过ELISA方法检测精子中cAMP信号通路中相关酶类的表达量。结果显示:与对照组相比,过表达组精子活率变化不明显,而干扰组有较明显的升高,精子畸形率差异不明显;与过表达组、干扰组绵羊精子中环磷酸腺苷酸的表达量差异极显著(P<0.01);与过表达组绵羊精子中PKA的表达量差异不显著(P>0.05),而干扰组显著升高(P<0.05)。综上所述,干扰NYD-SP27基因对精子中环磷酸腺苷酸和PKA的表达具有调控作用,并对绵羊精子活率具有一定的提高效果。本研究为进一步研究NYD-SP27基因调控绵羊精子发生及获能的分子机制奠定基础。
