DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响

背景与目的:变性高效液相色谱(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,DHPLC)是最近发展起来的一种灵敏而高通量的基因突变检测技术,在工作中我们发现某些因素,尤其是DNA聚合酶干扰DHPLC分辨力。本文详细地分析了具校正功能和非校正功能的DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响,旨在寻找更适合DHPLC分析的DNA聚合酶。方法:选择长度为268bp、317bp、590bp的3个代表性的片段用于DHPLC分析。选择6种品牌的TaqDNA聚合酶,1种Ampli-TaqgoldDNA聚合酶,4种具校正功能的DNA聚合酶(Pfu和Vent),用这11种酶扩增同一DNA片段,并进行DHPLC检测,分析并鉴定它们对DHPLC峰型的影响。结果:TaqDNA聚合酶对DHPLC分析产生两种明显的负面影响。一是在DHPLC图谱的主峰前,形成一个额外小峰,影响DHPLC对杂合双链的分辨能力。另一种影响是难以形成正常的DHPLC色谱图,导致DHPLC检测的失败。具校正功能的DNA聚合酶和TaqgoldDNA聚合酶对DHPLC几乎不产生这些负面影响。结论:具校正功能的DNA聚合酶比Taq聚合酶更适合于DHPLC突变或SNP分析,尤其是GC含量高的小片段或其它容易受干扰的片段应首选PfuDNA聚合酶用于DHPLC分析。

Peutz-Jeghers综合征脆性组氨酸三连体基因突变与癌变的关系

背景与目的:Peutz-Jeghers综合征(Peutz-Jegherssyndrome,PJS)是一种常染色体显性遗传性疾病。脆性组氨酸三连体(fragilehistidinetriad,FHIT)基因是定位于3p14.2脆性位点区域的重要抑癌基因。我们以往的研究结果认为PJS患者在3p14.2区域可能存在易感基因。本文旨在明确PJS患者FHIT基因突变与癌变的关系和FHIT基因的改变及规律。方法:应用变性高效液相色谱(DHPLC)分析、聚合酶链反应-单链构象多肽分析技术(PCR-SSCP)和DNA测序方法,对6个PJS家系中的15个患者及其20例正常家族成员的FHIT基因进行了研究。结果:在6个家系中,有1位患者的FHIT基因第159位核苷酸由G→T,相应的第54位密码子编码的氨基酸由谷氨酸变成终止密码子;在第62位密码子处存在碱基G插入,使读码框架发生移位,在第111位密码子处提前出现终止密码子;在2例癌变患者的息肉标本DNA和癌标本DNA中检测到FHIT基因第8外显子的纯合性缺失;在3个散发的PJS患者中发现,患者与其母亲在第8外显子,有相同的SSCP带型和DHPLC峰型,DNA测序结果显示,在第98位密码子处发生同义突变,由CAT→CAC,相应编码的氨基酸未发生改变,均为苏氨酸。另外,有7例患者和2例正常人在FHIT基因的第6内含子5'端第42位核苷酸位点发生由A→G的点突变。

重组人p53基因联合放疗、热疗治疗晚期软组织肉瘤的临床观察

目的:评价重组人p53基因腺病毒注射液(rAdp53)结合放疗、热疗治疗软组织肉瘤的疗效及安全性。方法:自2001年11月～2005年7月,采用rAdp53制剂“今又生”结合放疗、热疗共治疗晚期软组织肉瘤12例。“今又生”用法:每周1次,每次1×1012VP(病毒颗粒),平均8±2次。放疗方案:每次2Gy,每周5次,肿瘤量为16-70Gy/8-35次/2-8周,平均56.3±6.3Gy。热疗方法:采用浅部或深部热疗,每周1-2次,平均9±3次。观察肿瘤变化、患者的自觉症状改变与不良反应,并以CT评价疗效。结果:CR8.3%(1/12),PR33.3%(4/12),SD58.4%(7/12)。7例SD病人中亦达到止痛、减轻局部症状的目的。1年生存率为58.3%(7/12),2年生存率为16.7%(2/12),SD>6个月4例,实际临床获益率(CR+PR+SD>6月)为75%(9/12)。12例患者都接受多次“今又生”瘤内注射,除了出现一时性发热外,未发现其它不良反应。结论:软组织肉瘤瘤内注射rAdp53结合放疗、热疗是安全而有效的。rAdp53是一种很有潜力的治疗恶性软组织肿瘤的基因治疗药物。

乳腺癌p53基因突变规律及其预后意义

目的 探讨 p5 3基因突变在乳腺癌发生发展中的演变规律及其与预后的关系。方法 应用 PCR-单链构象多态性 (PCR- SSCP)分析方法检测 5 5例原发性乳腺癌患者 p5 3基因 5～ 8外显子的突变情况。结果 p5 3基因突变发生的频率为 36 .4% (2 0 / 5 5 ) , ～ 期和 ～ 期乳腺癌中 p5 3基因突变阳性率分别为 47.2 % (17/ 36 )和15 .8% (3/ 19) ,而且突变多发生在 5～ 6外显子。突变阳性患者其无病生存期明显较阴性者差 (P<0 .0 1) ,在 、 期乳腺癌中也以突变阳性患者的预后为差 (P<0 .0 5 )。结论 乳腺癌 p5 3基因突变多发生在病变早期 ,检测该基因的突变有可能成为判断 、 期乳腺癌预后的指标。

降低mRNA差异显示技术假阳性率的一种方法

为了探讨降低mRNA差异显示技术假阳性率的方法 ,进一步提高此技术的可靠性 ,提取了手术切除肝癌及非癌肝组织成对标本的总RNA ,逆转录获得cDNA片段 ,以mRNA差异显示方法筛选差异表达基因 ,选取较明显的一条差异表达条带 ,行进一步PCR扩增 .分别对PCR产物及其经TA克隆后随机挑选的 6个单克隆质粒DNA进行序列分析 ,并通过GenBank BLAST数据库进行序列的同源性比较 ,以Northern杂交予以来源确认 .自 72 0余条扩增条带中共选出 2 8条差异条带 .序列分析及同源性比较表明 ,所选择条带的PCR产物为一可能的新基因片段 ;而随机选择的 6个TA克隆质粒DNA中 ,有 4个为同一已知基因片段 ,一个为另一已知基因片段 ,一个为一可能的新基因片段 .同源性比较表明 ,PCR产物直接测序所得序列与TA克隆质粒DNA的 6个片段不具同源性 .结果表明 ,mRNA差异显示条带可能由 1条以上分子量相似的片段构成 ,直接对PCR产物行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,是导致出现假阳性片段的原因之一 .将PCR产物进行TA克隆 ,对单克隆质粒DNA进行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,可能是解决此问题的一种较好方法 .

外源性p53基因对人胃癌细胞的放射增敏作用

目的 :评价外源性 p5 3基因对人胃癌细胞放射敏感性的影响。 方法 :以复制缺陷型重组腺病毒为载体 ,将人野生型p5 3基因导入不同 p5 3状态的 4种人胃癌细胞系 ,用免疫组化法及Westernblot法检测 p5 3基因在胃癌细胞中的表达 ;用细胞存活份数来表示细胞的生长抑制情况 ;用流式细胞计数、细胞DNA片段化分析和TUNEL检测细胞凋亡。结果 :在高效靶比病毒剂量下 ,外源 p5 3基因在 4种胃癌细胞的胞核中均高效表达 ,并可使细胞产生明显的G2 /M阻滞和凋亡 ,使细胞存活份数明显减少。而且这种作用不依赖细胞内在的p5 3基因状态。单独照射4Gy ,对野生型 p5 3细胞的生长抑制和致凋亡效应明显 ,而对其它 3种细胞的作用较弱。照射 4Gy结合Ad p5 3时 ,外源p5 3基因可显著增强照射引起的G2 /M期阻滞和凋亡及生长抑制作用 ,对 4种胃癌细胞放射增效比高达2 .3～ 3.6。结论 :腺病毒载体介导的野生型 p5 3基因转染

大蒜油诱导细胞凋亡的实验研究

我们在证明大蒜油具有明显提高荷瘤小鼠生命率和抑瘤率等一系列实验研究的基础上，又用现代技术证明了其抗癌作用的某些机理。本文利用ＤＮＡ凝胶电泳、流式细胞术等方法研究了大蒜油对人早幼粒白血病ＨＬ－６０细胞的杀伤作用。研究表明该药在一定剂量的范围作用６小时诱导ＨＬ－６０细胞凋亡表现出典型的细胞凋亡特征。

胃癌c－Ha－ras基因突变分析方法的建立及临床应用研究

本文应用多聚酶ＤＮＡ链延伸反应产物限制性酶切片段多态性分析（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）和单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）两种方法同时检测了２０例胃癌中ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因突变．本文显示ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ均是检ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因突变的简便、快速和敏感的方法，适用于临床大批量肿瘤标本的检测。

C－Ha－ras癌基因高表达与胃癌临床行为的关系

应用ＲＮＡ斑点杂交、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和免疫组织化学技术检测了２０例胃癌病员癌组织中ｃ－Ｈａ－ｒａｓｍＲＮＡ和Ｐ２１蛋白的表达。统计学结果表明，胃癌组织中ｃ－Ｈａ－ｒａｓｍＲＮＡ过度表达和肿瘤淋巴结转移状态密切相关（Ｐ＝０．０３３），随着胃癌临床病程进展，肿瘤细胞中ｃ－Ｈａ－ｒａｓＰ２１表达水平逐渐升高（Ｐ＝０．１１２）。提示ｃ－Ｈａ－ｒａｓ癌基因高表达可能是胃癌形成过程中的关键步骤，ｃ－Ｈａ－ｒａｓ癌基因产物可作为胃癌新的生物学标志来判定肿瘤的预后并指导临床治疗。

大蒜素对人胃癌细胞BGC823 cyclin D1和p27^(Kip1)表达的影响

背景与目的:在研究大蒜素抑制人胃癌细胞BGC823恶性增殖,将其阻滞于G1期并诱导BGC823细胞凋亡的分子机制及其靶基因过程中,我们发现cyclinD1和p27Kip1蛋白在G1期阻滞中起重要作用。本实验从mRNA和蛋白水平探讨大蒜素对人胃癌细胞BGC823cyclinD1和p27Kip1表达水平的影响。方法:用25μg/ml大蒜素处理BGC823细胞,并分别提取对照组和大蒜素处理组的总RNA和总蛋白,然后采用RT-PCR和Westernblot法检测大蒜素处理前后cyclinD1和p27Kip1mRNA和蛋白的变化。结果:经25μg/ml大蒜素处理BGC823细胞24h,cyclinD1蛋白表达下调,p27Kip1蛋白表达上调,处理48h上述变化更明显。而mRNA水平未见明显改变。结论:大蒜素可影响cyclinD1和p27Kip1蛋白的表达,而不影响mRNA的转录。

一组与胃黏膜病变演化及早期癌变相关基因的鉴定及生物学意义

目的:鉴定能够特异性识别肿瘤生物学行为和预测肿瘤早期发生的分子标志谱,为胃癌早期诊断和有效防治提供实验依据和理论基础。方法:利用优化的70 mer的22K-Oligo基因芯片杂交和生物信息学分析,建立了胃癌(gastric cancer,GC)和癌旁形态学正常组织(normal appearing tissue,NAT)差异基因表达谱。通过设立以混合的正常胃黏膜组织作为共同参照(common reference,CR),将胃癌和配对癌旁形态学正常组织表达无明显差别的一类基因分离出来,这些基因主要是参与细胞增殖、代谢和分化过程的调控。在此基础上鉴定出一组与胃黏膜病变演化和细胞癌变早期相关的差异表达基因。结果:利用半定量RT-PCR,免疫组织化学染色方法对差异表达基因进行了验证,获得了与芯片表达谱数据一致的结果。进一步的生物信息学分析和实验研究明确了3个有代表性的基因(EGR1、CYR61和ADAMTS1)在胃癌及癌旁形态学正常组织、异型增生、肠上皮化生和非癌患者正常胃黏膜组织中的表达变化。癌和配对形态学正常组织表达水平未见明显差异的这一组基因,在肠化和异型增生组织中,mRNA表达水平明显高于正常胃黏膜组织。结论:肿瘤患者癌旁形态学正常组织中的基因表达模式已经发生了改变。EGR1、CYR61和ADAMTS1基因过量表达参与胃黏膜病变的演化过程,这一组基因的异常表达可能是胃癌发生的早期事件之一。

连黛胶囊抗胃癌的药理特性与临床应用

目的观察连黛胶囊防治胃癌的药理活性与临床疗效方法采用MNNG诱发胃癌大鼠进行药理实验,基因蛋白表达用免疫组化法检测,细胞分子药理采用甲基绿-派诺宁染色、吖啶橙染色、原位末端标记、琼脂凝胶电泳、免疫组化、MTT、流式细胞仪分析、615近交系小鼠皮下成瘤等方法进行,药理基因差异条带检测采用mRNA差异显示法,临床观察随机单盲设计结果试药灌胃使大鼠胃癌发生率明显降低,使p21ras和c-erbB2表达阴性(对照组阳性).试药血清可抑制MGC-803细胞生长和诱导细胞凋亡.盐酸小檗碱(试药的主要有效成分)可使SGC-7901和MGC-803细胞软琼脂集落形成率降低,增殖抑制及移植成瘤率降低;能抑制MGC-803细胞生长,诱导细胞凋亡,使bcl-2弱阳性表达;能抑制BGC-823细胞生长,并出现基因差异显示条带.临床观察31例胃肠癌患者,服药1mo能改善证候,提高生存质量,提高NK细胞和CD3水平.结论连黛胶囊具有防治胃癌的功效,作用机制与抑制癌基因蛋白过表达和诱导癌细胞凋亡有关,有药理作用靶基因存在.

抗原处理相关转运因子在小儿急性白血病患者中的表达及其临床意义

背景与目的:抗原处理相关转运因子(transporterassociatedwithantigenprocessing,TAP)参与免疫监视,因而可能与肿瘤发生有关。本文旨在探讨急性白血病TAP分子表达及其临床意义,探讨急性白血病的治疗策略。方法:采用RT-PCR检测34例初治急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)(初治组)、15例复发ALL(复发组)及20例急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)患者骨髓中TAP亚单位TAP1和TAP2的表达。20例无全身性疾病外科住院患儿作为对照组。使用数码成像分析仪测定并计算扩增条带的相对于阳性内对照GAPDH的吸光度(A)值。结果:ALL初治组和ALL复发组的TAP1A值(分别为0.448±0.167和0.169±0.021)及TAP2的A值(分别为0.196±0.180和0.112±0.020)均低于对照组,P均<0.01;AML组TAP2的A值低于对照组(P<0.01);ALL复发组TAP1的A值低于ALL初治组,P<0.05;ALL初治组复发者(6/34)TAP1的A值(0.215±0.159)较持续完全缓解(constantcompleteremission,CCR)者低(24/34,0.462±0.189,P<0.05)。结论:小儿ALL和AML均存在TAP分子低表达,这可能促使白血病细胞逃避免疫监视;TAP1亚单位低表达可能与ALL的复发有关。

PCR-RFLP 方法测定 ras 癌基因点突变

曾使用 PCR-RFLP 方法分析过 c-Ha-ras 癌基因第12密码子的点突变.因N-ras 基因第12位密码子、K-ras 基因第12和13位密码子无已知的限制性内切酶的酶切位点,不能使用 PCR-RFLP 方法分析这些位点的突变.在 PCR 引物的3′端引入一个误配的碱基使之正好成为某限制性内切酶的酶切位点,这样便能使用PCR-RFLP 技术分析 c-Ha-ras 基因第61位、N-ras 基因第12位、K-ras 基因第12和13位密码子的点突变.

人胃癌细胞系中p53抑癌基因变异的检测及其序列分析

ｐ５３抑癌基因由于点突变，缺失或易位等方式而丧失活性是多种肿瘤发生发展的重要机理之一。本文应用聚合酶链式反应─—单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法，对四种人胃癌细胞系ＭＧＣ８０３，ＢＧＣ８２３，ＧＣ７９０１和ＰＡＭＣ－８２中ｐ５３基因的第５、６、７、８四个外显子进行检测，结果发现，ＰＡＭＣ－８２的第５和第８外显子，ＧＣ７９０１的第６外显子存在突变。ＰＣＲ－直接测序证明，它们分别在１７４位、２８０位、２０４位密码子发生缺失Ｇ，ＧＣ→ＣＧ，ＡＴ→ＣＧ转变，因而可使其编码的ｐ５３蛋白分别发生移码突变，Ａｒｇ→Ｔｈｒ，Ｇｌｕ→Ａｌａ，而丧失肿瘤抑制功能。实验结果表明，ｐ５３基因在胃癌发生发展过程中，尤其是较晚阶段具有重要作用。

泛素-蛋白酶体途径与恶性肿瘤关系的研究进展

泛素 蛋白酶体途径是调节多种细胞生物学过程的重要机制 ,也是恶性肿瘤相关调节异常的潜在靶点 ;这种途径通过其特殊的蛋白酶体裂解活性 ,可上调或下调某些抑癌基因、转录因子和细胞周期素等的表达以及改变MHC Ⅰ限制性抗原肽的生成 ,从而参与恶性肿瘤的发生和发展。

大蒜油对人胃癌细胞间通讯的影响

本文借助于激光扫描共聚焦显微镜、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交等技术，研究了大蒜油对人胃癌ＢＧＣ－８２３细胞的增殖抑制作用。研究结果表明，大蒜油对细胞形态结构和细胞间通讯有明显的影响，可上调抑癌基因ｐ５３、ｐ２１等的表达水平。以上结果提示大蒜油有诱导肿瘤细胞向正常分化的作用。

C－Ha－ras癌基因低甲基化在胃癌形成中的作用

应用ｃ－Ｈａ－ｒａｓ（６．６Ｋｂ）探针检测人类胃癌组织中Ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因序列中５’－ＣＣＧＧ－３’甲基化状态，根据胃组织ＤＮＡ用ＨｐａＩＩ酶切、杂交后所显示的杂交带的位置和出现的频率不同，并且与Ｍｓｐｌ酶切、杂交带型比较来判定ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因甲基化程度的差异。本组胃癌ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因低甲基化发生率是４５％，癌旁组织中发生率是１５％，ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因低甲基化是胃癌发生的重要早期事件。

导入Rb、p53、p16和H-ras反义RNA对人胃癌细胞恶性增殖的影响

构建Rb、p16、p53、H-ras反义RNA的逆转录病毒载体,利用脂质体介导和病毒感染的方法将其分别转入—存在Rb基因部分缺失、p16低表达、p53缺失和H-ras点突变的胃癌细胞系.观察这些基因对该细胞生长及致癌性的影响,探讨肿瘤相关基因在人胃癌发生、发展过程中的作用.结果表明,通过基因重组技术将多种基因分别重组至逆转录病毒载体PLXSN中,经鉴定获得正插及反插有该基因的重组质粒.将这些质粒分别用脂质体介导和病毒感染的方法转染BGC823细胞,G418筛选2～3周后,获得较高的转染效率.对转染后细胞DNA、RNA进行分析,证明外源性基因已整合人BGC823细胞并获稳定表达.表达有外源性p16、p53基因和H-ras反义RNA的裸鼠致癌性均有明显的抑制作用,而Rb基因对BGC823的恶性增殖能力没有明显抑制.这一结果表明p16、p53、H-ras几个基因的异常可能是导致这一个细胞癌变及最终发展成胃癌的主要原因.本实验进一步明确了胃癌的发生、发展是多基因变异累积的结果.