人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

构建人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因表达载体。合成3个连续重复的人β-酪蛋白启动子中干扰素γ活化序列(gamma-activated sequence,GAS)并将其克隆至pGL3-Promoter荧光素酶报告基因载体。测序鉴定构建的载体,然后将其转染入人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts,HELF)中检测荧光素酶的表达活性。测序结果表明,3×GAS序列正确;双报告基因系统检测荧光素酶活性表明,构建的报告基因具有启动子活性。成功构建的人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因表达载体,为进一步研究干扰素γ诱导的JAK-STAT信号通路提供了必要的试验材料。

碱法水解大豆异黄酮工艺条件研究

为提高大豆总异黄酮中的染料木黄酮含量,用碱水解大豆异黄酮粗品,促使丙二酰基异黄酮转化为葡萄糖苷型异黄酮,再对其进行酸水解。单因素和正交实验研究表明,温度是主要的影响因素。由正交实验得出大豆异黄酮碱水解后再进行酸水解的最佳工艺路线为:用1.0 mol/L NaOH溶液,料液比1∶10,温度65℃,水解时间20 m in,后用1 mol/L盐酸,55℃水解2 h,样品中以染料木黄酮计的异黄酮总含量由287.09μg/g提高到532.76μg/g。

人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23与宿主蛋白IGFBP4相互作用的鉴定

目的:利用蛋白质相互作用的技术筛选与pUL23相互作用宿主蛋白,为研究pUL23蛋白对人巨细胞病毒繁殖的影响提供线索。方法:通过酵母双杂交系统从人胚肾cDNA文库筛选与pUL23相互作用的宿主蛋白;通过GST-pu ll-down技术研究二者体外物理性相互作用;免疫共沉淀技术进一步研究二者在胞内相互作用。结果:Pu ll-down技术、免疫共沉淀技术确定了宿主蛋白IGFBP4与pUL23具有相互作用。结论:上述结果为研究pUL23蛋白调节病毒自身繁殖功能提供重要依据。

正交试验法优选连梅颗粒提取工艺

目的优选连梅颗粒的提取工艺,为制剂的开发提供参考。方法以小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀含量为观察指标,采用L9（3-4）正交试验,观察加水量、提取时间及提取次数对水提工艺条件的影响。结果最佳提取工艺参数为加10倍量水提取3次,每次1小时。结论优选的提取工艺方法简单、合理可行,为生产工艺的确定提供了实验依据。

稳定表达人巨细胞病毒pUL49蛋白人胚肺成纤维细胞系的建立

目的用逆转录病毒载体介导的基因转移方法,建立稳定表达人巨细胞病毒(HCMV)UL49基因的HELF细胞系。方法首先应用RT-PCR从感染HCMV的HELF细胞RNA中扩增UL49基因,克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-N1上,以此构建重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-FLAG-UL49,并转染AmphoPack-TM-293细胞,收集逆转录病毒,感染HELF细胞,经G418抗性筛选出阳性细胞。结果经IFA、RT-PCR及Western blot检测到UL49基因在稳定细胞系中表达。结论 HELF-PLEGFP-N1-FLAG-UL49稳定细胞系构建成功。此细胞系为进一步研究HCMV pUL49蛋白的功能提供了一个有力工具。

利用酵母双杂交系统筛选与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的病毒编码蛋白

人巨细胞病毒(HCMV)UL23基因编码病毒皮层蛋白,该基因缺失时,病毒在人包皮成纤维细胞(HFF)中的繁殖速度加快.为进一步阐述HCMV UL23基因编码产物pUL23的功能及调控机制,采用鸟枪法构建了融合于GAL4活性区域的HCMV Towne株基因组随机表达文库.利用酵母双杂交技术,以pGBKT7-UL23为诱饵质粒,从构建的HCMV基因组表达文库中筛选到与pUL23相互作用的病毒编码蛋白pUL24.GST-pull down实验和免疫共沉淀实验进一步确认两种病毒蛋白之间的相互作用.结果表明,构建的HCMV基因组表达文库能够用于GAL4酵母双杂交系统筛选与诱饵蛋白相互作用的病毒自身编码蛋白.病毒蛋白pUL23和pUL24之间具有相互作用,这为进一步阐述pUL23在HCMV感染过程中的功能提供依据.该研究为揭示HCMV病毒感染机制奠定了基础.

稳定表达人巨细胞病毒蛋白pUL23细胞系建立及其功能研究

目的:建立稳定表达人巨细胞病毒UL23基因的HELF细胞系,研究病毒蛋白在宿主细胞内行为,为进一步研究人巨细胞病毒蛋白pUL23的功能提供依据。方法:通过PCR技术从人巨细胞病毒基因组中扩增出UL23基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-N1-FLAG-UL23。将该载体导入Am-phoPackTM-293细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染HELF细胞,HELF经持续G418抗性筛选后获得稳定表达UL23基因的细胞系。采用激光共聚焦显微镜观察病毒蛋白在细胞内的定位。结果:RT-PCR、Western blotting结果证实病毒基因UL23能够整合到宿主细胞基因组中,并能在宿主细胞中稳定表达病毒蛋白。共聚焦显微镜观察到病毒蛋白pUL23定位于细胞质,处于细胞核周边。结论:利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,成功构建了稳定表达UL23基因的转基因细胞系。该病毒蛋白在宿主细胞质中的定位,提示病毒蛋白发挥功能的空间位于细胞核周边,有利地推进了人巨细胞病毒蛋白pUL23功能研究的进程。

穿心莲软胶囊对脂多糖发热模型家兔解热作用及其机制研究

目的探讨穿心莲软胶囊对脂多糖发热模型家兔解热作用及其机制。方法建立脂多糖发热家兔模型,观察不同时间点穿心莲软胶囊对发热家兔体温的影响,绘制平均体温反应曲线,计算最大体温上升高度(△T)和体温反应指数(thermal response index,TRI);用放免法测定脑脊液和下丘脑组织中环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量;用化学荧光法测定下丘脑组织中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量。结果与模型组比较,穿心莲软胶囊能显著抑制脂多糖发热模型家兔体温升高;降低脑脊液、下丘脑组织中cAMP含量(P<0.05,P<0.01),同时升高下丘脑组织中5-HT含量(P<0.05)。结论穿心莲软胶囊对脂多糖发热模型家兔有良好的解热作用,其解热作用机制可能与下调下丘脑和脑脊液中cAMP、上调下丘脑中5-HT含量有关。

青蒿素硫酸羟氯喹复方对大鼠佐剂性关节炎的作用研究

目的观察青蒿素硫酸羟氯喹复方(Artemisinin-Hydroxychloroquine,AH)对佐剂性关节炎模型大鼠的作用,探讨AH治疗类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的药效及机制。方法于大鼠右后足跖皮内注射Freund’s完全佐剂致炎造模,成模后连续给药至致炎后第30天,并记录实验期间大鼠的体质量、足肿胀度、关节炎指数;给药结束后,采集腹主动脉血清、左足踝关节组织;应用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中干扰素γ(IFN-γ)的水平,并进行踝关节组织病理学检查,综合评价药物对大鼠佐剂性关节炎的影响。结果与模型对照组比较,AH的中、高剂量组明显降低AA大鼠继发性足肿胀度(P<0.05),并且减轻踝关节的破坏程度,AH的低、中、高剂量组均明显降低关节炎指数(P<0.05)和炎性因子IFN-γ水平(P<0.01)。结论 AH的中、高剂量组对大鼠佐剂性关节炎有一定的抗炎作用,可缓解佐剂性关节炎大鼠的关节炎症状,并且可能会缓解、修复关节病理损伤。

防御素对母猪生产性能及仔猪生长性能的影响

为研究防御素对母猪生产性能及仔猪生长性能的影响,选择3～5胎健康状况良好、体况相近的母猪36头,共分娩产出仔猪422头,随机分为对照组和基因重组防御素组,跟踪记录母猪的生产性能及仔猪的生长性能。结果显示,基因重组防御素组与对照组相比,初生仔猪死亡率降低56.25%,弱仔率降低26.36%,木乃伊率下降56.25%,初生重增加15.71%;15日龄仔猪个体重增加12.68%,日增重提高17.32%,发病率降低29.47%,成活率提高8.88%;38日龄时,仔猪个体重提高16.85%,日增重增加34.11%,发病率降低25.15%,成活率提高10.75%。试验表明,防御素能够明显改善母猪的生产性能,同时显著提高仔猪的生长性能。

妊娠母猪采食防御素效果观察

为观察妊娠母猪采食防御素的效果,试验选择50头3～6胎健康状况良好且体况相近的妊娠母猪,随机分成2组,对照组和试验组各25头猪,每组5个重复,每重复5头母猪。对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中添加一定比例的防御素,跟踪记录母猪的生产性能。结果表明,试验组与对照组相比,木乃伊胎率下降51.23%(P<0.01),总死胎率降低36.25%(P<0.01),初生均质量提高7.74%(P<0.05)。试验结果表明,妊娠母猪采食防御素后,生产性能显著提高。

连梅颗粒治疗2型糖尿病的作用机制研究进展

糖尿病是全球性的慢性代谢性疾病,针对其的治疗是世界关注的热点问题。通过这些年的临床观察和动物实验发现,江西省中医院名老中医伍炳彩教授40余年的临床实践经验方——连梅颗粒对于治疗早期2型糖尿病有明确的疗效,其具有益气生津、滋阴补血之功。本文基于连梅颗粒治疗2型糖尿病的作用机制研究的相关报道,对其作用机制作一综述。

防御素在“7060”高效养猪模式中的功效探索

众所周知，猪场的利润来自商品猪的出售，因此，如何使猪“出栏多、长得快”成为养殖户普遍关注的问题。“出栏多”，就要增加母猪产仔数和仔猪成活率；“长得快”，就要提高日增重、缩短饲养周期。对此，有人提出“7060”高效养猪模式，指最大限度提高70日龄猪的体重，

断奶仔猪饲喂防御素的效果

为了观察断奶仔猪饲喂防御素的效果，在广州增城朱村场旺猪场进行了试验。选择健康状况良好、体况相近的21～25日龄断奶仔猪450头，随机分成两组，对照组225头，防御素组225头，每组设9个重复，每个重复25头。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加2‰的防御素，跟踪记录仔猪的生长性能。

基因工程防御素对初生仔猪健康的影响

为观察基因工程防御素对初生仔猪健康的影响，在河南省信阳市潢川县仁和镇黄国牧业种猪场进行了试验。试验分2批进行：第1批选择3—4胎健康状况良好、体况相近的怀孕母猪40头，随机分成2组，对照组20头，防御素组20头，每组设4个重复，每个重复5头母猪；第2批选择5～6胎健康且体况接近的孕产母猪50头，同样分为2组，对照组25头，防御素组25头，每组设5个重复，每个重复5头母猪。2批试验中，对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加5‰的防御素，分别记录初生仔猪的各项指标。结果显示，两批试验防御素组与对照组相比，初生健仔率、初生均重显著提高，初生弱仔率、木乃伊率、总死胎率明显减少。试验表明，基因工程防御素能够提升初生仔猪健康度。

防御素对母猪生产性能的改善

试验选择3～6胎健康、体况相近的妊娠母猪114头,随机均分成两组。对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中加2‰的防御素,研究防御素对母猪生产性能的影响。结果显示,试验组与对照组相比,弱仔率降低了8.76%(P<0.05),死胎率减少28.45%(P<0.01),断奶成活率提高了8.23%(P<0.05),断奶均重增加了5.98%(P<0.05),母猪发病头次降低52.73%,仔猪发病率下降了37.83%(P<0.01)。结果表明,防御素能明显改善母猪的生产性能,提高养猪的经济效益。

基因重组防御素对母猪生产性能的提升

为评估基因重组防御素对母猪生产性能的影响,在江西省吉安市峡江县兴达养殖场进行了试验。选择4～6胎健康状况良好、体况相近的妊娠母猪48头,随机分成2组,对照组24头,试验组24头,每组设4个重复,每个重复6头母猪。对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中添加0.2%的基因重组防御素,跟踪记录母猪的生产性能。结果显示,试验组与对照组相比,活仔率提高了11.82%(P<0.05),健仔率增加了13.32%(P<0.05),死亡率减少了75.65%(P<0.01)。试验表明,防御素能明显提升母猪的生产性能。

青蒿素羟基氯喹复方对大鼠佐剂性关节炎的防治作用研究

目的 观察青蒿素羟基氯喹复方(AH)预防性给药对佐剂性关节炎(AA)大鼠的保护作用,探讨AH防治类风湿性关节炎的药效及机制。方法 在大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂复制关节炎模型。致炎前1 d开始灌胃给药,连续给药至造模后30 d。收集致炎前后大鼠体质量、足肿胀度、关节炎指数等数据,观察预防性给药对大鼠原发性病变和继发性病变的影响;于实验终点采用ELISA法测定大鼠外周血中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素4(IL-4)含量;计算胸腺、脾脏及肾上腺指数;取大鼠踝关节行HE染色,对比组间组织病理学改变。结果 与正常对照组比较,模型对照组大鼠原发性足肿胀度(P<0.01)、关节炎指数(P<0.01)、血清中TNF-α和IL-1β含量(P<0.01)、踝关节病理形态结构评分总值(P<0.01)均明显升高。与模型对照组比较,AH各剂量组原发性足肿胀度在致炎后6、30、60、72 h明显下降(P<0.05,P<0.01),关节炎指数从第15天起明显下降(P<0.01);AH中、高剂量组佐剂性关节炎大鼠继发性足肿胀度下降程度从第15天开始明显下降(P<0.05,P<0.01),且从第24天起恢复至接近正常组水平(P>0.05)。AH各剂量均可明显减少大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量(P<0.01),其病理形态结构评分总值明显低于模型对照组(P<0.01)。结论 青蒿素羟基氯喹复方预防性给药对佐剂性关节炎大鼠的关节骨质破坏具有保护作用,其作用机制可能与减轻炎症反应、减少破骨细胞增生有关。

保育仔猪采食防御素的效果和经济效益分析

试验选择23～27日龄健康、体况相近的保育仔猪224头,随机分成2组。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中添加0.2%的防御素,观察保育仔猪采食防御素的效果并进行经济效益分析。结果显示,与对照组相比,试验组保育仔猪日增重提高了10.31%(P<0.05),料重比降低了11.31%(P<0.05)。经济效益分析表明,保育仔猪饲粮中添加防御素的投入产出比约为1∶17.81。

人肺癌细胞A549λ噬菌体cDNA文库的构建与鉴定

目的构建人肺癌细胞A549λ噬菌体cDNA文库,为抗肺癌药物的筛选和药物作用分子机理的研究奠定基础。方法提取人肺癌细胞A549λ总RNA,用DnaseⅠ处理后,采用RNA 5’末端移动反转录(switching mechanism at 5′end of RNA transcript,SMART)技术合成双链cDNA,切胶回收去除短片段,依次用蛋白酶K和SfiⅠ进行酶切,并与经过酶切的λTriplEx2载体连接后进行体外包装,得到初级文库。初级文库扩增后,测定扩增文库滴度,并通过PCR鉴定插入片段。结果构建的人肺癌细胞A549λ噬菌体初级文库库容为1.88×10^(7)pfu/mL,扩增文库滴度为2.50×10^(9)pfu/mL,插入cDNA片段为500~3000 bp。结论成功构建了人肺癌细胞A549λ噬菌体cDNA文库,为进一步筛选治疗肺癌的药物作用分子机理奠定了基础。