温肾通络止痛方对小鼠H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响

背景:骨骼依赖血管与骨细胞之间的密切连接来维持完整性,骨骼处在生理低氧环境中,因此在低氧环境下研究血管生成与骨生成具有重要意义。目的:探究在低氧环境下温肾通络止痛方对H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响及相关机制。方法:运用酶消化法及流式分选技术,分选小鼠H型血管特异型骨微血管内皮细胞;应用骨髓贴壁法分离获取小鼠骨髓间充质干细胞;采用Transwell小室以及缺氧培养工作站建立两种细胞低氧共培养体系,使用50,100μg/m L质量浓度温肾通络止痛方冻干粉进行干预;通过划痕迁移实验与管形成实验评估共培养体系内H型骨微血管内皮细胞的成血管功能;通过碱性磷酸酶染色与茜素红染色评估共培养体系内骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;使用Western Blotting与q-PCR检测共培养体系内H型骨微血管内皮细胞中PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白表达及mRNA表达。结果与结论:(1)与常氧组相比,低氧组H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度均显著升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强(P<0.05);PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达升高(P<0.05);(2)与低氧组相比,经不同质量浓度温肾通络止痛方干预后H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度进一步提高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强(P<0.05),PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达也进一步升高(P<0.05)。结果表明:低氧条件下H型血管生成及骨生成可能与PDGF/PI3K/AKT信号轴有关,而温肾通络止痛方可能通过激活PDGF/PI3K/AKT信号轴促进“H型血管生成-骨生成”作用从而防治骨质疏松症。

骨质疏松视野下骨脂代谢相关调控网络的研究

骨髓间充质干细胞作为多能干细胞的一种,在骨髓微环境中可主要分化为成骨细胞、脂肪细胞等,而这种成骨和成脂分化之间的相互制约和交互关系可被归纳为骨脂平衡,并且这种动态平衡对骨稳态的维持起着至关重要的作用。在骨脂交互作用的过程中,骨髓脂肪组织是沟通其信号的重要载体和关键途径,并介导着骨髓微环境中的多种代谢调控过程。近年来,随着研究人员对骨脂代谢方面研究的深入,其防治骨质疏松的相关调控网络逐渐得到揭示,但是目前对于在生理病理条件下骨脂分化状态及其分子机制仍缺少系统阐释。因此,本文拟通过总结相关文献并结合我们的研究,在明确骨髓微环境视野下骨脂平衡相关概念的基础上,深入剖析其分子机制,以便为骨质疏松症的防治提供新思路。

基于骨脂代谢的血脂指标与绝经后妇女骨密度相关性研究

目的 探讨绝经后妇女骨密度与血脂指标的相关性。方法 录入2016年3月至2021年3月在南京中医药大学附属医院骨伤科就诊的1686名绝经后妇女的基本临床数据,按BMI分为偏瘦组、正常组、超重组、肥胖组,检测患者腰椎、髋部不同部位的骨密度、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A1(APOA1)、载脂蛋白B(APOB)、载脂蛋白E(APOE)、脂蛋白a[LP(a)]等指标,对绝经后妇女的骨密度进行分组比较并研究其与血脂指标的相关性,并进行多元线性回归分析。结果 肥胖组绝经后妇女的股骨转子间、股骨内部、髋部骨密度较正常组、偏瘦组、超重组高,差异有统计学意义(P<0.05);TG、APOE是腰椎骨密度的独立影响因素,APOA1与HDL-C是髋部骨密度的独立影响因素。其中,TG与腰椎骨密度呈正相关,APOE与腰椎骨密度呈负相关,APOA1与髋部骨密度呈正相关,HDL-C与髋部骨密度呈负相关。结论 绝经后妇女相对较高的血脂水平可能是骨密度的保护因素,如HDL-C、TG、APOE、APOA1等指标是骨质疏松症的重要影响因素。

石吊兰HPLC指纹图谱的建立

目的建立石吊兰HPLC指纹图谱。方法石吊兰85%甲醇提取物的分析采用Thermo Hypersil GOLD-C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相乙腈-0.1%磷酸,梯度洗脱;体积流量1 mL/min;检测波长334 nm;柱温35℃。结果 21批样品指纹图谱中有12个共有峰,并指认了12号峰为石吊兰素,相似度0.100~0.980。结论该方法稳定可靠,可用于石吊兰的质量控制。

基于网络药理学及体内实验探讨温肾通络止痛方对原发性骨质疏松症小鼠MAPK信号通路的调节作用

目的:采用网络药理学和体内实验验证的方法探讨温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症的潜在作用机制。方法:选择TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM与OMIM、GeneCards数据库筛选温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症的有效活性成分及靶标基因;利用Cytoscape 3.7.2建立其网络关系图;通过STRING在线分析平台构建PPI网络并运用NetworkAnalyzer拓扑学分析进一步筛选核心靶点;借助DAVID进行GO和KEGG富集分析,筛选具有统计学差异的GO过程与KEGG通路(P<0.05)。以去卵巢的方式建立原发性骨质疏松症模型,21只SPF级C57BL/6J雌性小鼠随机分为假手术组、模型组、温肾通络止痛方组,假手术组切除卵巢周围相等质量的脂肪组织,模型组和温肾通络止痛方组切除双侧卵巢;灌胃相应药物8周后,苏木素-伊红(HE)染色观察股骨组织形态学变化,酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠血清IL-6、TNF-α的表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)检测IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表达。结果:网络药理学方法筛选出温肾通络止痛方防治原发性骨质疏松症的有效活性成分包括山柰酚、槲皮素、木犀草素等203个,靶标基因包括IL-6、TNF-α、MAPK8等154个。KEGG富集分析预测温肾通络止痛方主要通过PI3K/Akt、TNF、MAPK等信号通路发挥抗骨质疏松作用。HE染色结果显示,与假手术组比较,模型组小鼠骨小梁稀疏,骨髓腔间隙较大,温肾通络止痛方可改善模型小鼠骨小梁密度,减小骨髓腔间隙。与模型组比较,温肾通络止痛方能够降低模型小鼠血清中IL-6、TNF-α的表达水平(P<0.01),降低IL-6、TNF-αmRNA表达(P<0.01),升高Runx2的mRNA的表达(P<0.01),并同时降低p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症具有多成分、多靶点、多途径的特点,可能通过IL-6、TNF-α靶点调控MAPK信号通路影响炎症反应等来发挥防治原发性骨质疏松症的作用。

基于多元统计分析方法的人字果药材中木兰花碱的含量与环境因子的关联性分析

目的:建立人字果药材中木兰花碱的含量测定方法;对影响人字果药材内在质量的环境因子的相关性进行分析,初步揭示影响人字果药材中次生代谢产物木兰花碱累积的主导环境因子。方法:采用HPLC法,建立人字果药材中木兰花碱的含量测定方法;结合多元统计分析方法对人字果药材中木兰花碱含量与环境因子的相关性进行分析。结果:23批人字果药材中木兰花碱的含量在1.6%~14.9%之间;多元统计分析显示人字果药材中木兰花碱的累积与平均气温月较差、等温性、最热季降水量、海拔呈强烈正相关;与气温季节性变动系数、气温年较差呈较强负相关。结论:本实验建立的方法简便,准确,可用于木兰花碱的含量测定;初步揭示影响其成分累积的主导环境因子,为人字果药材的质量控制及其资源合理开发利用提供理论依据。

苗药红禾麻野生与引种药材UPLC指纹图谱研究

采用超高效液相色谱法,探寻建立苗药红禾麻药材的UPLC指纹图谱测定方法,并比较分析野生与引种药材之间的指纹图谱差异。结果表明,不同红禾麻原产地药材指纹图谱相似度结果为0.212~0.769,存在明显的产地差异;每个野生药材与对应的引种药材的指纹图谱相似度计算结果大部分在0.75以上。建立的红禾麻指纹图谱方法快速、特征性强、重复性好,可用于红禾麻药材的整体质量评价。红禾麻野生药材之间、野生与对应引种药材之间的指纹图谱差异,表明环境因素影响其化学成分的变化。

黔产红花龙胆药材HPLC指纹图谱及芒果苷含量分析

目的:建立黔产红花龙胆药材的HPLC指纹图谱测定方法,并测定分析其主要成分芒果苷的含量,分析评价黔产红花龙胆药材的质量。方法:采用HPLC-DAD技术,色谱柱为DIKMA Diamonsil spusil-C 18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,检测波长为242 nm,柱温25℃;指纹图谱采用相似度评价软件,结合聚类分析和主成分分析进行分析。依照2015年版《中国药典》红花龙胆质量标准中的芒果苷含量测定方法。结果:建立了黔产红花龙胆药材的HPLC指纹图谱,标定17个共有峰,11批红花龙胆药材相似度为0.589~0.993,聚类分析和主成分分析结果归为3类,11批红花龙胆药材中芒果苷的平均含量为1.8%。结论:该指纹图谱测定方法重复性良好,构建的黔产红花龙胆HPLC指纹图谱可全面反映其化学成分信息,为该药材的质量控制和质量评价提供了参考。

温肾通络止痛方调控巨噬细胞极化对破骨细胞分化的影响

目的观察温肾通络止痛方对巨噬细胞极化的作用,探讨其对破骨细胞分化的影响。方法利用脂多糖建立炎性巨噬细胞模型,小鼠骨髓单核细胞体外建立破骨细胞诱导模型。通过CCK8法检测不同浓度温肾通络止痛方冻干粉对巨噬细胞增殖的影响。将实验分为正常组、模型组、中药组,通过ELISA检测巨噬细胞培养基上清中IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-10的表达,利用蛋白免疫印迹法检测NF-κB信号通路相关蛋白及INOS、TNF-α蛋白的表达。采用TRAP染色及F-actin免疫荧光检测温肾通络止痛方对破骨细胞分化的影响。结果CCK8结果显示温肾通络止痛方冻干粉48h 125μg/mL对巨噬细胞的增殖效果最好(P<0.01)。酶联免疫法检测结果表明,与正常组比较,模型组巨噬细胞上清液中IL-6、TNF-α的表达升高,IL-10、TGF-β的表达降低;经温肾通络止痛方干预后IL-6、TNF-α的表达降低,IL-10、TGF-β的表达升高,且各组间差异具有统计学意义(P<0.01)。蛋白免疫印迹法结果表明,与正常组比较,模型组中p-p65/p65、TNF-α、INOS蛋白表达升高(P<0.01),IκBα的表达降低(P<0.01),与模型组比较,中药组中p-p65/p65、TNFα(P<0.01)、INOS(P<0.01)的蛋白表达降低,IκBα的表达升高(P<0.05)。TRAP和F-actin检测结果显示,各中药组均能减少破骨细胞数目,减小F-actin环面积,并减少环的数目,且各组之间差异具有统计学意义(P<0.01)。结论温肾通络止痛方可能通过抑制NF-κB信号通路的相关蛋白的表达,抑制巨噬细胞M1极化,从而抑制破骨细胞的分化。

温肾通络止痛方对炎性骨丢失小鼠MAPK信号通路的影响

目的:观察温肾通络止痛方对炎性骨丢失小鼠骨微结构和骨吸收的影响,探讨其抗炎性骨丢失的作用机制。方法:将50只小鼠随机分为正常组,模型组,阿仑膦酸钠组,温肾通络止痛方低、高剂量组,每组10只。腹腔注射脂多糖(5 mg/kg,1次/周)构建小鼠炎性骨丢失模型。采用HE和Micro CT方法观察股骨结构,ELISA法检测血清中IL-6、IL-1β、ALP、TRAP的表达量,RT-PCR法检测胫骨组织中NFATC1、CTSK mRNA的表达,Western blot法检测胫骨组织中JNK、ERK、p38、NFATC1、CTSK蛋白表达。结果:与模型组比较,温肾通络止痛方高、低剂量组均可改善骨小梁密度,减小骨髓腔间隙,缓解小鼠骨质流失;增加3D BMD、BV/TV、Tb.Th,降低Tb.Sp;降低血清中IL-1β、IL-6、ALP、TRAP的表达(P<0.01);降低NFATC1、CTSK mRNA的表达水平(P<0.05),并抑制NFATC1、CTSK、p38、ERK、JNK蛋白表达(P<0.01)。结论:温肾通络止痛方能够显著改善炎性介导的小鼠骨质流失,其作用机制可能与MAPK信号通路有关。