基于PASS技术的EGFR基因突变比例检测方法的建立与评价

目的近期临床研究发现EGFR-TKI并非对所有EGFR基因激活突变的NSCLC患者都有效,提示EGFR-TKI的治疗效果也可能与NSCLC患者中EGFR基因突变比例相关。本研究基于平行等位基因特异性测序(Parallel Allele-Specific Sequencing,PASS)方法,建立一个稳定可靠的EGFR突变基因比例检测平台。方法构建野生型和突变型EGFR基因重组质粒,建立EGFR基因突变比例检测的PASS平台,从灵敏度、精密度以及准确度对PASS检测平台进行性能评价。结果建立的PASS平台可用于EGFR基因点突变和缺失突变的检测,能够检测到的最小基因拷贝数为1,能够稳定检测到的最小基因拷贝数为10,在野生型基因中最低能检测出0.01%的突变基因。线性回归分析显示,检测到的突变型/野生型比例与预期的突变型/野生型比例呈良好的线性相关(R_(2)=0.9962)。结论该方法的建立能够对EGFR基因突变比例进行灵敏、准确测定,这对其在临床中的应用奠定了良好的技术基础,对于评价EGFR基因突变比例与EGFR-TKI靶向治疗NSCLC患者疗效的关系也具有重要意义。

不同毒力的分枝杆菌感染促进小鼠RAW264.7巨噬细胞自噬及mTOR和AKT磷酸化

目的探讨不同毒力分枝杆菌感染对巨噬细胞自噬水平的影响。方法分别用表达绿色荧光蛋白(GFP)的结核分枝杆菌标准株H37Rv、卡介苗(BCG)和耻垢分枝杆菌Ms1-2c株(Ms)感染小鼠RAW264.7巨噬细胞,流式细胞术检测巨噬细胞的自噬水平,激光共聚焦显微镜观察细胞内吞噬体与溶酶体的共定位,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、蛋白激酶B(AKT)和磷酸化的AKT(p-AKT)蛋白表达。结果与对照组相比,RAW264.7巨噬细胞感染H37Rv、BCG和Ms 24 h后,感染组的自噬水平均显著增加,Ms感染组的自噬水平最高;各感染组的LC3-Ⅱ蛋白表达均上调,H37Rv、BCG和Ms感染的细胞内吞噬体与溶酶体的共定位率分别为(11.33±0.88)%、(18.33±0.88)%和(48.67±0.66)%,Ms感染组的分枝杆菌与溶酶体共定位最明显。分枝杆菌感染巨噬细胞后,mTOR和AKT表达无明显改变,但其磷酸化水平均显著升高。结论分枝杆菌感染诱导巨噬细胞发生自噬,同时促进mTOR和AKT的磷酸化。

LRG47/EBP50重组慢病毒靶向载体疫苗增强RAW264.7小鼠巨噬细胞的抗结核免疫及机制

目的构建免疫相关p47 GTP酶/埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白结合磷蛋白50(LRG47/EBP50)基因共表达重组慢病毒靶向载体,探讨该基因疫苗在抗结核免疫中的作用。方法利用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒载体pLenti-EBP50-LRG47,包装成慢病毒LV-EBP50-LRG47后,H37Rv菌株感染RAW264.7小鼠巨噬细胞。荷菌量计数检测各组杀菌能力,流式细胞术检测巨噬细胞的自噬和凋亡水平,Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达,紫外分光光度计法检测一氧化氮(NO)的表达水平。结果重组慢病毒LV-EBP50-LRG47感染巨噬细胞后,可成功过表达EBP50和LRG47,与对照组相比,LV-EBP50-LRG47可显著抑制胞内H37Rv的生长,LV-EBP50-LRG47感染巨噬细胞自噬和凋亡水平显著上调,iNOS和NO表达水平显著上调。结论LRG47/EBP50共表达的巨噬细胞自噬、凋亡增强,iNOS、NO产生增加,显著抑制胞内H37Rv的生长。

长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1对巨噬细胞极化影响的研究

目的研究长链非编码RNA(lnc RNA)肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)对巨噬细胞极化的影响。方法采用佛波酯诱导人THP-1细胞分化为成熟的巨噬细胞,IFN-γ/LPS刺激诱导M1型极化,IL-4刺激诱导M2型极化,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测各组细胞中MALAT1的表达。si RNA干扰巨噬细胞MALAT1表达,加入IL-4继续诱导M2型极化,RT-q PCR检测极化相关基因表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-12、CCL22、IL-10的水平。si RNA干扰M2型巨噬细胞MALAT1表达,研究其对M2极化表型的影响。结果 MALAT1在M2型巨噬细胞中表达显著升高,M1向M2极化改变MALAT1表达升高,而M2向M1极化改变MALAT1表达降低。MALAT1干扰后,IL-4诱导的M2型巨噬细胞TNF-α、IL-12分泌升高,CCL22、IL-10分泌降低;CXCL10、CXCL11、HLA-DR表达升高,CCL17、CCL18、CD163表达降低。M2型巨噬细胞MALAT1干扰后,TNF-α、IL-12分泌升高,CCL22、IL-10分泌降低。结论 MALAT1参与调控巨噬细胞极化,干扰MALAT1表达有效抑制M2型巨噬细胞极化,促进M1型巨噬细胞极化。

显微镜观察药物敏感度检测技术在结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测中的应用

目的建立显微镜观察药物敏感度检测(MODS)技术快速测定吡嗪酰胺(PZA)耐药性,并探讨其在结核分枝杆菌(MTB)PZA耐药性测定中的应用价值。方法用24孔细胞培养板建立MODS技术,进行PZA耐药性检测,并对最佳检测条件进行探讨。将该技术用于112株MTB临床分离株的PZA耐药性检测,将检测结果与罗氏绝对浓度法的药敏结果进行比较分析,对不符合的菌株进行最低抑菌浓度(MIC)测定和MTB pncA基因序列测定分析。结果 MODS检测PZA耐药性的最佳测定条件为pH=5.7,药物浓度为100μg/mL。如以绝对浓度法药敏结果为判断标准,MODS检测PZA耐药性的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为95.7%、88.4%、92.9%、93.0%和92.7%。MODS与绝对浓度法检测结果不符的8株菌株中,MIC和pncA基因测序结果表明,有6株的MODS结果与MIC和pncA基因测序结果相符,2株的结果不符。结论 MODS检测MTBPZA耐药性具有快速、操作简便、价廉等优点,与绝对浓度法药敏结果有较高的符合率,可作为PZA耐药性的快速筛选方法之一。

慢性粒细胞白血病急粒变伴嗜酸性粒细胞增多综合征1例

患者,男,57岁,因无明显诱因出现左下肢肿痛,右侧大腿瘀斑2周于2017年11月14日入院。2017年6月左下肢外伤后出现大量瘀斑,伴肿胀,当地医院医对症治疗后有所好转,2017年10月因病情复发并进展,伴有轻度胸闷(活动后症状加剧),遂来我院就诊。既往有胃溃疡出血病史18年,高血压史2年。入院查体:T 37.9℃,P 116次/min,R 18次/min,BP 130/82 mmHg。

探讨慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞表面共刺激分子的表达变化及临床意义

目的探讨慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞表面共刺激分子的表达变化及临床意义。方法选取南昌大学第一附属医院收治的慢性乙型肝炎患者40例作为观察组,所有患者均予以外周血T淋巴细胞表面CD4*、CD8*、CD4*/CD8*比值、CTLA-4等共刺激分子的表达变化测定,同时选取健康患者39例作为对照组,统计两组患者的测定结果。结果观察组中治疗组、治疗无效组、治疗有效组CD4*、CD8*T淋巴细胞亚群绝对表达量均明显下降,低于对照组(<0.05);CD8*T淋巴细胞亚群相对表达量明显高于对照组(<0.05),另外未治疗组、治疗无效组CD4*/CD8*比值明显高于治疗有效组、对照组(<0.05)。结论进行共刺激分子表达变化研究可以为慢性乙型肝炎治疗提供一定的依据,为深入评价细胞免疫功能提供了新的研究角度。

播散性荚膜组织胞浆菌感染继发噬血细胞综合征1例

噬血细胞综合征(hemophagocytic syndrome,HPS)是由多种因素引起的淋巴细胞、组织细胞非恶性过度活化、增殖,并分泌大量炎性因子,进而引起机体一种严重的炎症反应,临床分为原发性HPS和获得性HPS[1]。原发性HPS常见于儿童,继发性HPS以成人居多。感染、风湿性疾病、肿瘤等是引起继发性HPS常见原因。HPS患者若未及时干预,病死率极高[2]。

慢性中性粒细胞白血病1例

慢性中性粒细胞白血病(chronic neutrophilic leukaemia,CNL)是一种极为罕见的BCR-ABL融合基因阴性的骨髓增殖性肿瘤,临床特征表现为外周血和骨髓中成熟阶段中性粒细胞持续增多,常伴脾脏增大,易与不典型慢性粒细胞白血病和慢性粒单核细胞白血病等疾病相混淆[1]。目前文献公开报道的CNL病例约150例,多为零散报道,缺乏系统性描述,且该病鉴别诊断难度较大,易于造成漏诊、误诊[2]。南昌大学第一附属医院收治CNL患者1例,现将其临床资料报告如下,以期帮助临床医生进一步认识该病。

南昌地区消化道溃疡患者奥美拉唑药物相关CYP2C19基因多态性分布

目的分析南昌地区消化道溃疡患者奥美拉唑代谢相关细胞色素P4502C19(CYP2C19)基因型的分布情况。方法采用等位基因特异PCR结合荧光探针技术,对218例病人进行CYP2C19*1、*2、*3基因检测。结果CYP2C19*1、*2、*3的基因频率分别为67.2%、28.4%、4.4%;而CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3的频率分布分别为45.0%、39.9%、4.6%、6.9%、3.2%、0.5%;其快代谢型、中代谢型、慢代谢型的频率分别为45.0%、44.5%、10.6%;不同性别之间CYP2C19基因型及代谢型差异均无统计学意义(P>0.05),各年龄段各代谢型差异也无统计学意义(P>0.05)。结论南昌地区消化道溃疡患者CYP2C19基因型主要以CYP2C19*1/*1为主,代谢表型以快代谢为主,可以此评估奥美拉唑疗效,为患者制定个体化医疗方案,更大程度的提高疗效。

氧化锆陶瓷表面Ag-TiO_2抗菌薄膜的制备及性能

采用Sol-Gel法制备5%(原子分数)银掺杂二氧化钛溶胶,并采用浸渍提拉法将其涂覆于氧化锆表面。利用X射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)等研究手段测试薄膜性能,采用抑菌圈实验和MTT实验评价其抗菌性和细胞毒性。结果表明:采用浸渍提拉法可在氧化锆表面制备一层均匀的Ag-TiO2薄膜,薄膜表面可见散在分布的Ag颗粒;经500℃煅烧后为锐钛矿TiO2,Ag掺杂可抑制TiO2晶粒的生长,并增加了TiO2薄膜的光催化活性;该薄膜在无光照条件下具有良好的抗菌性能,抑菌距离达到4.5mm左右;细胞毒性为Ⅰ级,符合口腔生物材料的应用标准。

江西地区心脑血管患者CYP2C19基因多态性检测

目的分析江西地区细胞色素P4502C19(CYP2C19)基因型的分布情况。方法采用等位基因特异PCR结合荧光探针技术,对3 408例患者进行CYP2C19~*1、~*2、~*3基因检测。结果 CYP2C19~*1、~*2、~*3的基因频率分别为63.3%、32.0%、4.7%;而CYP2C19~*1/~*1、CYP2C19~*1/~*2、CYP2C19~*1/~*3、CYP2C19~*2/~*2、CYP2C19~*2/~*3、CYP2C19~*3/~*3的频率分布分别为40.1%、40.5%、5.9%、10.3%、3.0%、0.3%;其快代谢型、中代谢型、慢代谢型的频率分别为40.1%、46.4%、13.5%;不同性别之间CYP2C19基因型及代谢型差异均无统计学意义(P>0.05),各年龄段各代谢型差异也无统计学意义(P>0.05)。结论江西地区心脑血管患者CYP2C19基因型主要以CYP2C19~*1/~*2为主,代谢表型以中代谢为主,可以此评估其氯吡格雷抵抗风险,从而精准地为患者制定个体化医疗方案,更大程度地降低不良心脑血管事件的发生。

长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1在结核感染中的表达及意义

目的：探讨长链非编码RNA（lncRNA）肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）在结核感染中的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR（ RT-PCR）技术检测75例肺结核病患者（结核组）及32例健康体检者（健康对照组）外周血单个核细胞（ PBMC）中MALAT1的表达量,分析其与结核病发生发展以及转归的相关性。采用RT-PCR技术检测感染结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis,Mtb）的人巨噬细胞（THP-1）中MALAT1的差异表达；用小干扰RNA诱导THP-1细胞中MALAT1沉默,检测Mtb感染后炎症因子TNF-α、IL-6的表达及THP-1细胞对Mtb杀菌功能的变化。结果 RT-PCR检测结果显示 MALAT1在肺结核患者 PBMC 中的相对表达水平是健康对照组的（4.05＆#177;0.86）倍,差异有统计学意义（P〈0.01）。 MALAT1在初治和复治肺结核病例中表达差异无统计学意义（P〉0.05）；MALAT1随结核病患者肺部空洞累及范围的增加而升高。肺结核患者PBMC中MALAT1表达量随着治疗时间逐渐下降,恢复至正常水平。 THP-1细胞感染Mtb后MALAT1表达显著上调（P〈0.01）；沉默MALAT1的THP-1细胞感染Mtb后TNF-α和IL-6水平显著升高（P〈0.01）。以Mtb感染后0 h时间点的细胞内荷菌量为基准,Mtb感染后72 h时沉默MALAT1的THP-1细胞内Mtb的存活率显著低于对照感染组（P〈0.01）。结论 MALAT1在结核感染过程中表达升高,且与结核的发展和转归有关。下调MALAT1表达可增强巨噬细胞对胞内Mtb的清除能力。

转录组测序分析融合基因在染色体核型正常髓系白血病诊断中的应用

目的应用高通量转录组测序分析染色体核型正常的髓系白血病患者中可能存在的融合基因。方法选择2017年5月至2019年1月南昌大学第一附属医院3例染色体核型正常并且常见融合基因阴性的髓系白血病患者为研究对象,通过高通量基因测序技术对患者骨髓单个核细胞进行转录组测序。采用Defuse软件分析转录组数据中的基因融合序列,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Sanger测序验证具有明确病理意义的融合基因。结果3例患者均经临床表现、骨髓细胞形态学、免疫学及组织化学染色确诊为髓系白血病,细胞遗传学检测为正常染色体核型,荧光原位杂交和RT-PCR检测BCR-ABL1、PML-RARA等常见融合基因均阴性。通过转录组测序和分析发现3例患者分别携带病理意义明确的罕见型融合基因BCR-FGFR1、CPSF6-RARG和NUP98-RARG。结论应用转录组测序可准确分析染色体核型正常的髓系白血病患者中可能存在的少见型融合基因。

慢病毒介导的 TACO-shRNA 通过促进吞噬体与溶酶体融合提高巨噬细胞清除结核分枝杆菌的能力

目的 构建以富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白（ TACO）基因为靶点的短发夹状RNA（ shRNA）表达慢病毒载体,鉴定其下调TACO表达的效果,以及对巨噬细胞吞噬和杀伤胞内结核分枝杆菌（ M.tb）的影响及相关机制. 方法 设计3条靶向小鼠TACO基因的shRNA表达片段及1条随机序列对照片段,插入慢病毒表达载体pSicoR 后利用293 T细胞进行病毒包装. 采用包装成功的慢病毒颗粒感染RAW264 .7细胞,分别采用real-time RT-PCR和Western blot方法鉴定干扰效果. 选择沉默效果最佳的重组慢病毒感染RAW264.7细胞,48 h后再采用M.tb对这些巨噬细胞进行感染,倍比稀释培养法进行细胞内荷菌量的检测,免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞内M.tb与溶酶体的共定位情况,cyto-ID细胞自噬检测试剂盒检测各组细胞的自噬水平,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达水平.结果 测序结果证实重组慢病毒表达载体均构建成功. 靶向TACO基因的3种重组慢病毒均可下调RAW264 .7细胞中TACO的表达,其中LV-pSRT1的效果最佳. LV-pSRT1感染组RAW264 .7细胞内的荷菌量在感染后0 h时即显著低于对照慢病毒（LV-pSRTc）感染组（5.50×104 vs 8.1×104, P〈0.05）. 以M.tb感染后0 h时间点的细胞内荷菌量为基准,M.tb感染后48 h和72 h时LV-pSRT1感染组RAW264.7细胞内M.tb 的存活率显著低于对照慢病毒感染组（48 h： 134.54% vs 213.58%, P〈0.05; 72 h：148.18%vs 262.96%, P〈0.05）. 与对照慢病毒感染组比较,LV-pSRT1感染组RAW264.7细胞内M.tb与溶酶体的共定位率显著上调（75.67%vs 10.66%, P〈0.05）,同时细胞的自噬水平显著上调（16.20%vs 8.50%, P〈0.05）,LC3Ⅱ的相对表达水平也显著提高（0.51 vs 0.34, P〈0.05）. 结论 TACO基因特异性RNAi慢病毒表达载体可有效抑制RAW264.7细胞中TACO的表达,抑制巨噬细胞对M.tb的吞噬能力,增强巨噬细胞对胞内M.tb的清除能力. 下调TACO表达对巨噬细胞杀伤胞内M.tb影响的机制与其通过自噬溶酶体途径提高M.tb吞噬体与溶酶体的融合有关.

lincRNA—cox2对小鼠RAW264．7巨噬细胞极化的影响

目的观察小鼠RAW264.7巨噬细胞不同极化状态下lincRNA-cox2表达变化，初步探讨lincRNA-cox2对巨噬细胞极化的影响。方法以IFN-γ/LPS刺激小鼠RAW264.7细胞诱导M1型极化，IL-4刺激RAW264.7细胞诱导M2型极化，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组细胞lincRNA-cox2的表达。设计并合成针对lincRNA-cox2基因的siRNA及无关序列，脂质体转染RAW264.7细胞，48 h后分别加入IFN-γ/LPS或IL-4继续诱导M1/M2型巨噬细胞，采用酶联免疫试验（ELISA）检测细胞因子IL-12及IL-10的分泌量；RT-PCR检测与巨噬细胞极化相关的iNOS、TNF-α、Arg-1、Fizz1的表达。将lincRNA-cox2-siRNA转染M1型巨噬细胞，检测其对M1极化表型的影响。结果RT-PCR结果显示，M1型巨噬细胞的lincRNA-cox2表达水平显著高于未极化细胞和M2型巨噬细胞。与对照组相比，lincRNA-cox2-siRNA转染RAW264.7细胞后，经IFN-γ/LPS诱导的M1型巨噬细胞中IL-12分泌降低，iNOS和TNF-α表达下降；而经IL-4诱导的巨噬细胞中IL-10产生增加，Arg-1和Fizz1表达升高。lincRNA-cox2-siRNA转染M1型巨噬细胞后，IL-12分泌降低，IL-10产生增加，其特点向M2样巨噬细胞转换。结论lincRNA-cox2参与调控小鼠巨噬细胞的极化，促进M1型巨噬细胞极化，抑制M2型巨噬细胞极化。