急性脊髓损伤大鼠血管重构与炎症反应的相关性研究

目的探讨大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后局部血管重构与炎症反应的相关关系,评估不同程度SCI的组织学改变。方法成年雌性SD大鼠116只,随机分为4组(n=29)。假手术组仅切除椎板暴露脊髓,不进行撞击;轻、中、重度损伤组以标准化的MASCIS脊髓撞击器,分别以12.5、25.0、50.0 mm高度撞击脊髓,建立急性SCI模型。造模后12、24 h及3、7、28 d取材,行RECA1和CD68免疫荧光双染色并定量分析阳性面积比,统计分析大鼠内皮细胞抗原1(rat endothelial cell antigen 1,RECA1)和CD68表达相关性;术后28 d免疫荧光双染色定性分析神经微丝(neurofilament-H,NF-H)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达情况。造模后12、24 h及3 d ELISA检测脊髓TNF-α、IL-1β和IL-6水平,并统计分析与微血管密度(RECA1)的相关性;12、24 h及3、7、28 d行HE染色以及28 d行尼氏体染色,评估组织结构及神经元破坏。结果免疫荧光染色显示,RECA1阳性面积比中度损伤组最大,之后依次为轻度损伤组、重度损伤组,假手术组最小;组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。CD68阳性面积比重度损伤组最高,之后依次为中度损伤组、轻度损伤组,假手术组最低;除24 h、28 d轻度损伤组和中度损伤组比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。各时间点假手术组SCI相应区域RECA1和CD68表达无相关(P>0.05)。SCI后12、24 h,轻、中度损伤组内RECA1和CD68表达成正相关(P<0.05),重度损伤组二者无相关(P>0.05)。3 d时轻、中、重度损伤组以及7 d时重度损伤组RECA1和CD68表达均无相关(P>0.05);7 d时轻、中度损伤组及28 d时轻、中、重度损伤组均成负相关(P<0.05)。随着损伤程度的加重,轻、中、重度损伤组轴突连续性中断逐渐加重、短缩甚至融合成团且数量逐渐减少;胶质细胞数量减少,形态渐不规则且胶质瘢痕致密。ELISA检测显示,假手术组各时间点TNF-α、IL-1β和IL-6水平均低于其他3组(P<0.05);除12 h时轻、中度损伤组IL-1β水平差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各时间点各组炎症因子水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3种炎症因子与SCI区域微血管密度相关(P<0.05)。组织学观察显示,SCI后脊髓组织的破坏与损伤程度相关,重度损伤组组织肿胀、出血及大量炎症细胞浸润,至后期空洞形成,灰、白质界限完全消失,正常神经元结构几乎不可见。结论轻、中度SCI后,急性期微血管密度与炎症反应均随损伤程度加大而增加。随着时间推移,远期不同程度SCI区域微血管密度与炎症反应均成负相关;SCI损伤程度越高,炎症反应越明显,组织破坏越严重。

慢病毒介导小干扰RNA干扰促分裂原和应激激活的蛋白激酶1对大鼠脊髓损伤的修复作用

目的探讨促分裂原和应激激活的蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1,MSK1)在大鼠脊髓损伤后的表达变化及对脊髓损伤的修复作用。方法雄性SD大鼠120只(体质量220～250 g),取其中70只随机分为假手术组和脊髓损伤组(n=35),脊髓损伤组按照Allen法制作大鼠脊髓损伤模型,假手术组仅打开椎板不损伤脊髓;造模后8、12 h及1、2、3、5、7 d取材(n=5)行Western blot检测MSK1及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达变化。另取20只SD大鼠同上法分组(n=10),于脊髓T10水平背侧深约0.8 mm处注射阴性对照慢病毒LV3NC稀释液,倒置荧光显微镜下观察1、3、5、7、14 d的转染效果,确定病毒最佳转染时间。将剩余30只SD大鼠随机分为单纯脊髓损伤组(A组)、脊髓损伤后转染阴性对照慢病毒LV3NC组(B组)和脊髓损伤后转染MSK1小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)组(C组),每组10只。于术后1、3、5、7、14 d行大鼠后肢功能BBB评分;于病毒最佳转染时间点取材行Western blot检测脊髓组织中MSK1及PCNA蛋白表达变化,并采用免疫荧光染色检测MSK1及PCNA在脊髓中的定位表达。结果 Western blot检测示假手术组各时间点脊髓组织中的MSK1及PCNA蛋白表达无明显变化。脊髓损伤组MSK1蛋白表达于伤后8 h开始逐渐下降,至伤后3 d降至最低,而后逐渐上升;PCNA蛋白表达与MSK1表达趋势相反。脊髓损伤组伤后1、2、3、5 d MSK1蛋白表达量显著低于假手术组,伤后8 h及1、2、3、5、7 d PCNA蛋白表达量显著高于假手术组,差异均有统计学意义(P<0.05)。脊髓损伤组及假手术组大鼠脊髓组织在慢病毒转染后各时间点均有较强的荧光表达,转染7 d内荧光强度与时间成正相关,7 d时达高峰。随术后时间延长,A、B、C组BBB评分均呈逐渐上升趋势,术后5、7、14 d C组BBB评分显著低于A、B组(P<0.05)。慢病毒转染7 d后,Western blot检测示C组MSK1蛋白表达量显著低于A、B组,PCNA蛋白表达量显著高于A、B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色显示MSK1在脊髓表达并存在于细胞核中,并与绿色荧光蛋白、神经元核抗原及神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)共定位。免疫荧光染色示,C组MSK1阳性细胞相对表达面积显著高于B组,PCNA、GFAP阳性细胞相对表达面积显著低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导MSK1 siRNA转染大鼠脊髓组织,能够有效沉默MSK1的表达,MSK1可能通过调控神经胶质细胞的增殖,在大鼠脊髓损伤修复中发挥一定作用。