转基因抗草甘膦棉花R1-3株系的分子特征鉴定

【目的】通过转化抗草甘膦除草剂基因G10aroA获得抗草甘膦除草剂的棉花转基因株系,对其进行分子特征鉴定分析,为今后棉花育种利用该株系提供必要的分子依据。【方法】利用农杆菌介导法,在草甘膦筛选条件下,通过组织培养获得棉花再生株系,利用Western blot对转基因棉花株系不同组织的外源蛋白表达进行检测;通过Southern blot确定株系中外源G10aroA整合位点的拷贝数;利用TAIL-PCR扩增外源基因整合位点侧翼序列,并通过NCBI BLAST工具比较分析其定位的染色体位置。【结果】通过草甘膦筛选,利用组织培养获得R1-3棉花再生株系;Western blot结果表明,外源基因在叶、苞叶、花、茎中均可正常表达,其蛋白大小约为46 kDa,与预期目标条带一致;基因组DNA酶切后杂交结果显示,R1-3株系外源序列的整合位点为单拷贝插入,其中,KpnⅠ酶切的杂交条带位于约6557 bp处,EcoRⅠ酶切的2条杂交带位于略大于4316 bp处;侧翼序列比对结果显示,外源序列融合到陆地棉A或D基因组的第11号染色体上,且在交换插入的过程中,左右边界的融合位点分别位于该染色体47525303和47525449处。另外,利用特异引物进行PCR鉴定,可知左侧融合位点可扩增出约300 bp的预期特定目标条带,右侧融合位点可扩增出约600 bp的预期特定目标条带。【结论】获得具有稳定遗传特征的R1-3转基因棉花株系,不同组织中外源基因编码的蛋白均有表达,提高了该株系对草甘膦的高抗性。含有G10aroA的外源序列为单个位点插入,融合位点位于陆地棉A或D基因组第11号染色体上,该融合位点处缺失约146 bp的核苷酸序列。

小麦TaTVP1基因的克隆与表达分析

[目的]发掘并研究小麦TaTVP1基因响应耐盐、耐旱等非生物胁迫的功能与机制,为小麦抗逆育种提供新的基因资源。[方法]利用PCR技术克隆小麦TVP1基因,扩增获得cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,进一步利用qRT-PCR技术分析其表达模式。[结果]小麦TVP1基因全长2 289 bp,编码762个氨基酸;其氨基酸序列具有12个跨膜结构,该结构中疏水氨基酸具有高度保守性,且肽链N末端与C末端均位于膜外,预测该跨膜结构可形成具有明显孔道的高级3D结构蛋白,推测与其具有的H+离子泵通道功能密切相关;系统发育树分析表明,TaTVP1蛋白与单子叶植物TVP1蛋白的同源性较高,该类蛋白在进化过程中单子叶和双子叶植物可形成2个明显的类群Ⅰ和Ⅱ;定量PCR分析表明,小麦中TVP1基因在根、茎中的表达量要明显高于叶、穗中,具有组织特异性,且不同材料间同一组织中该基因的表达趋势也存在差异,这可能与不同材料间的耐旱等抗逆性存在差异有关。[结论]克隆并分析了小麦TaTVP1基因,为进一步阐明该基因参与抵御非生物胁迫的机理奠定一定的研究基础。