新型冠状病毒Beta株灭活疫苗原液鉴别实验

目的建立特异性鉴别新型冠状病毒Beta株灭活疫苗原液的逆转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)并验证。方法在新型冠状病毒Beta株刺突蛋白(spike, S)受体结合域(receptor binding domain, RBD)中3个特异性突变位点的上下游保守区域设计引物S3F/S3R, 通过RT-PCR扩增843 bp目的DNA。对扩增产物进行测序, 与原型株的S基因序列进行对比, 通过3个特征突变识别Beta株。对该方法的重复性、专属性、耐用性和灵敏度进行验证。结果该方法能准确扩增出843 bp目的DNA, 经测序表明, 扩增产物与新型冠状病毒Beta株基因序列一致, 包含3个特征突变位点。取1批Beta株原液进行6次PCR, 测序结果显示与Beta株核苷酸序列一致。S3F/S3R引物只对S的RBD区域有扩增作用。Beta株原液4 ℃和-70 ℃放置8周, 仍然可以扩增出目的条带, 且测序结果正确。将原液提取RNA稀释成不同浓度后进行RT-PCR, 得出最低检测限为0.032 ng/μl。结论建立的RT-PCR具有良好的专属性、重复性、耐用性和灵敏度, 能成功区分新型冠状病毒原型株与Beta株, 可用于新型冠状病毒疫苗生产中原液的鉴别。

百日咳系列抗原的酶联免疫检测法建立及其在组分百日咳疫苗吸附原液中的应用

目的:建立百日咳毒素、百日咳丝状血凝素、百日咳黏附素3种抗原含量检测方法,用于组分百日咳疫苗吸附原液的检测。方法:制备抗百日咳毒素、抗百日咳丝状血凝素和抗百日咳黏附素3种兔多克隆抗体,利用棋盘滴定法确定检测条件,建立双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA法),并进行方法学的验证。结果:3种酶联免疫吸附法的线性相关良好(R^(2)>0.98),线性检测范围分别为1.25~20,2.5~40,0.625~10ng·mL^(-1);该方法的检测准确度高(回收率均在95%~115%),精密度良好(CV<10%)。结论:本研究建立了百日咳系列抗原的酶联免疫吸附法,可用于组分百日咳吸附原液解吸附方法及吸附原液稳定性的研究。

氢氧化铝佐剂对百日咳菌毛抗原的吸附特性分析

目的探索氢氧化铝[Al(OH)_(3)]佐剂对百日咳菌毛(fimbriae,Fim)抗原的吸附特性及在组分百日咳疫苗制备中的应用。方法通过Zeta电位确定Fim抗原和Al(OH)_(3)佐剂的等电点(pI);朗格缪尔(Langmuir)吸附方程计算不同氯化钠(NaCl)浓度下,Fim抗原在Al(OH)_(3)佐剂表面的最大吸附量,根据最大吸附量随NaCl浓度的变化趋势判断吸附作用力种类,分析不同浓度磷酸盐和pH对Fim抗原吸附率的影响。采用间接ELISA法检测不同磷酸盐浓度下配制的Fim-Al(OH)_(3)复合物免疫小鼠后的血清抗体效价。结果 Fim抗原的pI为5.5,其最大吸附量随离子强度(NaCl)增加而基本保持不变,吸附率随磷酸盐浓度增加而缓慢降低,但仍保持在90%以上。先加磷酸盐后吸附的复合物免疫小鼠后血清抗体滴度高于其他组。结论 Fim抗原与Al(OH)_(3)佐剂的吸附作用除了静电吸引外,还存在配基交换方式,不同配制方式获得的Fim-佐剂复合物免疫小鼠产生的血清抗体滴度不同,为百日咳疫苗配制中加入Fim抗原提供了数据支持。

百日咳菌毛抗原检测方法的建立及初步应用

目的建立百日咳菌毛(fimbriae, Fim)抗原组分纯化过程中含量监测的双抗体夹心ELISA方法。方法 Fim抗原免疫家兔获得多克隆抗血清,经辛酸-硫酸铵法纯化并用辣根过氧化物酶标记,采用棋盘滴定法确定最佳包被抗体浓度和酶标抗体最适稀释倍数,建立双抗体夹心ELISA检测法,并对其进行全面验证。结果棋盘滴定法确定包被抗体浓度为2μg/mL,最适酶标记抗体稀释倍数为2 000倍。验证双抗体夹心ELISA线性检测范围为15.625~250.000 ng/mL(相关系数r>0.99)。该方法与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒抗原、白喉类毒素(diphtheria toxin, DT)、破伤风类毒素(tetanus toxin, TT)、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖(Hib)、百日咳毒素(pertussis toxin, PT)、百日咳丝状血凝素(filamentous haemagglutinin, FHA)和百日咳黏着素(pertactin, PRN)抗原均无明显交叉反应,重复性好,专属性强,其他均符合常规质控要求。结论建立了Fim双抗体夹心ELISA检测法,为百日咳菌毛蛋白生产过程和以组分百日咳疫苗为基础的联合疫苗中Fim含量的质量控制提供有效技术手段。

Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液特异性鉴别试验RT-PCR法的建立及验证

目的建立Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液特异性鉴别试验的RT-PCR法,并对该方法进行验证。方法根据GIAIDS数据库中新型冠状病毒Omicron株及其他突变株和原型株的S基因序列差异设计并合成引物OSTF1、OS1R,提取Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液病毒RNA,逆转录为cDNA,利用对Omicron株S蛋白基因序列中的特异性插入及缺失核苷酸序列设计的引物对进行PCR扩增,扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。对建立的RT-PCR法进行重复性、中间精密度、专属性、耐用性及灵敏度验证,并用该方法鉴别6批Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗原液。结果Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液利用引物OSTF1/OS1R进行RT-PCR检测,可扩增出约460 bp的条带,而原型株、Beta株、Delta株新型冠状病毒灭活疫苗原液(Vero细胞)均无法扩增出条带;重复3次检测、2名实验人员分别在3 d重复3次检测、利用3种不同退火温度进行RT-PCR,Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液均可扩增出约460 bp的条带;原液蛋白浓度在0.04μg/mL以上、RNA浓度在0.128 ng/μL以上均可扩增出较亮的约460 bp的条带;6批Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液经RT-PCR检测,均可见约460 bp的条带。结论RT-PCR法专属性、重复性、中间精密度、耐用性和灵敏度均良好,可用于Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液鉴别。

二代测序在Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗毒种遗传稳定性研究中的应用

目的分析并监测Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗毒种遗传稳定性。方法毒种通过不同的方式,即未经过空斑纯化的毒种和空斑纯化的毒种,在细胞上进行连续传代后,收获细胞培养上清提取病毒核酸,利用二代测序进行病毒宏转录组分析,比较不同条件下Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗毒种的全基因组突变位点及突变频率和插入/缺失的差异。结果空斑纯化毒种连续传代后,ORF1ab和S基因序列上的高于5%的突变位点明显少于未经空斑纯化的毒种,且在纯化毒种全基因组中未检测到插入/缺失突变。结论通过二代测序技术,分析不同路径的毒种连续传代样本的全基因组序列,结果表明毒种经过空斑纯化后的遗传稳定性优于未纯化毒种,为灭活疫苗研发毒种的选育提供了科学依据。