登革病毒多价DNA疫苗构建及免疫保护效果验证

目的研究登革病毒(dengue virus,DENV)的多价DNA疫苗pVAX1-EDIII在小鼠体内的免疫原性及其保护作用。方法采用真核表达载体p VAX1,设计并构建含4种血清型登革病毒EDIII结构域的DNA疫苗。在第0、14和42天采用电脉冲肌肉导入方式免疫小鼠。末次免疫后1周,ELISA检测针对4种血清型登革病毒的血清特异性IgG抗体水平;ELISpot检测免疫后小鼠脾细胞分泌特异性IL-4、IFN-γ的水平;体内中和实验检测小鼠免疫后血清对感染DENV和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)乳鼠的保护效力。结果与对照组相比,电脉冲肌肉导入DNA疫苗诱导产生较高滴度的IgG抗体与较强的细胞免疫应答。免疫后血清对致死剂量DENV感染的3日龄乳鼠有完全保护作用,对ZIKV感染C57BL/c 1日龄乳鼠有部分保护作用。结论电脉冲肌肉导入登革DNA多价疫苗免疫可诱导针对4种血清型登革病毒的特异性体液免疫以及细胞免疫应答并能有效抵抗DENV的致死剂量攻毒,对ZIKV也能产生一定的保护效应,具有广谱抗黄病毒感染的潜力。

mRNA疫苗制备方法的优化及验证

目的筛选获得高效的mRNA疫苗制备方法,为mRNA疫苗研发提供参考。方法本研究使用了A、B、C三种不同的mRNA疫苗体外合成方法,比较筛选出最优方法并在小鼠体内进行了效果验证。结果3种方式合成的mRNA凝胶电泳条带清晰、完整,紫外分光光度法测定mRNA OD_(260nm)/OD_(280nm)均在1.9~2.0的范围之内,纯度较好。其中,C方法转录后mRNA的浓度最高且体外转录的eGFP mRNA转染细胞后,其表达量更高,持续时间更长。动物体内活体成像也表明,C方法转录的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)mRNA经脂质纳米颗粒递送可在动物体内高效表达,并且经该方法合成的登革病毒mRNA疫苗接种小鼠21 d后可产生体液免疫。结论通过对比筛选出的C方法为mRNA疫苗制备的最佳方法,可用于后续各类mRNA疫苗研发。

非洲猪瘟病毒感染相关调控基因以及毒力基因初步筛选

本研究旨在初步筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染过程中与宿主相互作用的调控基因以及毒力基因,为非洲猪瘟(African swine fever,ASF)特效药以及疫苗研发提供分子理论基础。利用GSE145954数据集和文献挖掘,分析ASFV强毒株和弱毒株感染后宿主差异表达基因;使用Metascape数据库对差异基因进行基因功能富集分析,通过交互基因检索工具(STRING)数据库建立蛋白相互作用网络,经网络拓扑结构筛选获得病毒感染宿主调控网络关键基因,随后在细胞水平筛选调控该关键基因的ASFV毒力基因。研究发现ECE1、CCL2、CTSB、SCARB2和CD14在ASFV感染单核巨噬细胞和动物全血中均明显上调,HMBS、DYNLL1、UBB、EZH2和SERPINE1则明显下调。蛋白质相互作用(PPI)分析表明,宿主UBB、CCL2、CTSB、EZH2、SERPINE1、CD14和DYNLL1为ASFV感染宿主调控网络关键基因,其中UBB占据核心地位。ASFV B119L、I215L以及MGF360-13L可抑制UBB的表达。结果提示,宿主UBB、CCL2、CTSB、EZH2、SERPINE1、CD14和DYNLL1为病毒感染宿主调控网络关键基因,其中UBB是非洲猪瘟病毒感染的核心基因。B119L、I215L以及MGF360-13L可抑制UBB的表达,为ASFV重要的毒力基因。

一种快速灵敏的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种经济快速、准确灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光定量PCR检测方法。方法对30个ASFV毒株来源的P72基因进行多重序列比对,根据其保守区域设计两对特异性引物,PCR扩增P72基因。以含ASFV P72基因保守区域的目的片段的重组标准质粒PUC57-P72为模板,建立荧光染料TB Green qPCR方法,绘制标准曲线并筛选最佳引物对。通过优化反应体系和条件,提高最佳引物对的检测灵敏性,并进行重复性检测。选用常见猪病毒如猪流感病毒H1N1、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸与ASFV标准质粒为模板进行特异性试验;通过检测已知ASFV阳性和阴性参考样品评估方法的符合率。结果优选的基于P72基因的特异性引物对及反应体系,能扩增1.0~1.0×10^(6)copies/μL的ASFV P72标准质粒,建立的标准曲线R^(2)可达0.9954;该方法最低可检测到1 copyies/μL的目的基因,优于TaqMan探针法扩增灵敏度;该方法的扩增反应采用两步法,耗时<1 h;方法的批内变异系数<1%,批间变异系数<2%;该方法针对ASFV扩增的特异性强,检测其它4种常见猪病毒均未发生交叉阳性反应;用该方法检测4份随机抽取的ASFV灭活参考样品均阳性,4份SPF级的巴拿马香猪组织样品均阴性,符合率为100%。结论建立的TB Green qPCR方法经济、快速,灵敏、特异,可作为非洲猪瘟的分子诊断方法。