壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的移植研究

目的 探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。 方法 应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤 ,对裸鼠大面积 (直径 2 0 mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。 2 4只 8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植 (AS)组、壳多糖膜覆盖物 (CH)组及对照组 ,术后进行大体观察 ,并在 3、7、14和 2 1天应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监测。 结果 AS组在移植第 3天 ,组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合 ,有少量毛细血管长入移植物 ,皮肤移植物颜色与自体皮肤颜色接近 ;随着时间的延长 ,移植物中毛细血管的数量逐渐增多 ,表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层 ,角化征象加强 ,有角化物脱落 ;真皮层细胞数量增多 ,网架逐渐降解 ,分泌的细胞外基质成分增多 ;第 14天 ,创面基本愈合 ,修复区皮肤颜色与正常皮肤颜色非常接近 ,瘢痕小 ,无需进行二次植皮。CH组至移植第 14天 ,结痂未完全脱落 ,创面未愈合 ,颜色较 AS组深 ;第 2 1天创面愈合 ,遗留较大瘢痕 ,与正常皮肤区分明显 ,而对照组的结痂脱落 ,创面大而深 ,颜色深红。 结论 以壳多糖为基质网架构建的组织工程化皮肤具有良好的组织相容性 ,可应用于皮肤缺损的移植修复。

硒、维生素E和多不饱和脂肪酸复合作用与克山病发病关系的研究

目的 :研究硒 (Se)、维生素 E(VE)及多不饱和脂肪酸 (PUFAs)三因素复合作用与克山病发病的关系。方法 :测定南北方典型克山病病区主食粮中 VE及 Se含量 ,并用克山病病区粮 (及其添加豆油 )饲料喂养大鼠 70 d,测定各组织中 α-、γ-生育酚 (α- ,γ- Toco)等含量。结果 :病区玉米和大米在 Se低的同时 ,α- Toco含量亦显著低于非病区对照。饲克山病病区粮饲料大鼠血浆、红细胞膜、心肌线粒体、肝线粒体均处于低 α- Toco状态。饲料中添加富含 PUFAs的豆油时 ,细胞膜中 α- Toco含量进一步下降 ,血浆LPO、CK、α-羟丁酸脱氢酶 (α- HBDH)显著增加。结论 :PUFAs长期负荷 ,可使实验动物体内抗氧化能力下降 ,细胞膜严重受损 ;Se、VE及

豆油对饲克山病病区粮大鼠抗氧化能力的影响

以非病区粮对照、克山病病区粮及其添加豆油（６０ｇ豆油／ｋｇ饲料）饲料喂养大鼠７０ｄ，测定各组织中维生素Ｅ及血浆中脂质过氧化物含量。结果显示：无论是病区粮饲料组，还是非病区粮饲料组，在饲料中添加豆油后，动物血浆中α－生育酚（α－Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）含量均增加，而心肌线粒体中α－Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ含量则下降，肝线粒体中α－Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ和γ－Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ含量均下降，红细胞膜中α－Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ含量亦有降低趋势。另外，饲料中长期添加豆油，可使大鼠血浆中脂质过氧化物含量显著增加。说明，随着多不饱和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）摄入量的增加，膜系统α－Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ的消耗量亦增加，ＰＵＦＡｓ长期负荷，可使饲克山病病区粮（低硒低维生素Ｅ）饲料动物体内的抗氧化能力下降。

壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的动物移植实验(英文)

背景:治疗由烧伤或疾病等引起的大面积全层皮肤缺失最为常见的和有效的方法就是皮肤移植修复,但目前面临的最大障碍是皮肤供体不足。以自体皮肤细胞作为种子细胞构建的组织工程皮肤是解决这一矛盾的最理想途径。目的:探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。设计:随机对照实验。单位:一所大学再生医学科学研究所及皮肤科。材料:实验于1998-09/2001-07在吉林大学细胞工程研究室完成。选用新生Wistar大鼠20只;8周龄雄性裸鼠24只。方法:应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤,对裸鼠大面积(直径20mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。24只8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植(artificialskin,AS)组、壳多糖膜覆盖物(chitosan,CH)组及对照组(controlgroup,CG,术后进行大体观察,并在3,)7,14和21d应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监测。主要观察指标:①实验动物大体观察情况。②修复区血供情况的红外热像观察。③组织学观察。结果:AS组在移植第3天,移植的组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合,有少量毛细血管长入移植物,皮肤移植物颜色与自体皮肤颜色接近;随着时间的延长,移植物中毛细血管的数量逐渐增多,表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层,角化现象加强。

以壳多糖为基质网架构建大鼠组织工程皮肤

目的 探索以壳多糖为基质网架构建组织工程皮肤的可能性。方法 将体外传代培养的大鼠表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞 ,分别接种在预先制备的多孔三维壳多糖基质网架的两侧 ,经液 -气界面培养 ,构建出复层人工皮肤。分别用光镜和电镜观测该复层人工皮肤的组织形态及超微结构的动态变化。结果 光镜下可见 ,本实验构建的组织工程皮肤由表皮和真皮构成。随着培养时间的推移 ,表皮逐渐成熟、分化 ,真皮逐渐形成 ,基质网架逐渐降解、被吸收 ,并由真皮细胞所分泌的细胞外基质所取代。结论 以壳多糖为基质网架构建的组织工程皮肤 。

大鼠角朊细胞的无滋养层培养

目的 :探索一种新的表皮角朊细胞 (角蛋白细胞 ,KCs)的培养方法。方法 :应用含有新生牛血清并附加多种调节因子的 DMEM- F1 2培养基 ,对大鼠表皮 KCs进行无滋养层法培养。结果 :大部分 KCs在接种后 36h贴壁 ,并有集落形成。培养至第 9天 ,细胞接近铺满单层。结论 :采用无滋养层法培养大鼠 KCs不仅可行 ,而且具有细胞成活率高、避免滋养层细胞影响等优点。

克山病病区主食粮中维生素E和硒含量的研究

为探讨缺硒（Ｓｅ）、缺维生素Ｅ（ＶＥ）对克山病发病的影响，对云南、四川、陕西、内蒙古、吉林等省份的典型克山病病区主食玉米、大米中α－生育酚（α－Ｔｏｃｏ）、γ－生育酚（γ－Ｔｏｃｏ）及Ｓｅ含量进行了研究。发现病区玉米和大米在Ｓｅ低的同时，α－Ｔｏｃｏ亦显著低于其非病区粮对照，但γ－Ｔｏｃｏ却无此现象。提示：病区人群从主食中摄取的Ｓｅ和α－Ｔｏｃｏ的量都低于其非病区人群对照；北方病区主食粮玉米中α－Ｔｏｃｏ含量，虽然比其非病区对照低，但远高于南方病区主食粮大米中α－Ｔｏｃｏ含量。所以，只用α－Ｔｏｃｏ绝对量来衡量机体ＶＥ缺乏与否是不够的，还必须同时考虑影响α－Ｔｏｃｏ的其它因素，如Ｓｅ、多不饱和脂肪酸等。

饲克山病病区粮大鼠体内维生素E水平的研究

饲克山病病区粮大鼠体内维生素Ｅ水平的研究周余来，罗坤，姜熙罗，安汝国（白求恩医科大学地方病研究所，长春１３００２１）关键词维生素Ｅ，血浆，红细胞膜心肌线粒体，肝线粒体，克山病ＡＳｔｕｄｙｏｎＶＥＬｅｖｅｌｓｏｆＴｉｓｓｕｅｓｏｆＲａｔｓＦｅｄｏｎＣｅ...

大骨节病病区主食粮中VE及Se含量的研究

为进一步探明缺Se缺VE因素对大骨节病的作用,本文对陕西、吉林不同大骨节病区主食粮小麦和玉米中VE(α-Toco、γ-Toco)、Se含量进行了测定分析。首次证明,大骨节病区主食粮小麦和玉米在Se低的同时,α-Toco亦显著低于其非病区对照。提示:病区居民从主食中摄取的Se和α-Toco的量都低于非病区人群对照,其体内在缺Se的同时,很可能伴随着VE的缺乏或处于VE的相对缺乏状态。

纳米细菌纤维素膜的表征与生物相容性研究

利用木醋杆菌静态培养法制备的由纳米纤维组成的细菌纤维素膜具有超细的三维网络结构和适当的孔隙率. 利用光镜、扫描电镜和原子力显微镜对其进行结构表征发现, 细菌纤维素膜具有极为精细的纳米网络结构, 冻干膜的孔径约为0.6-2.8 μm; 纤维素带宽度约为50~80 nm. 采用湿重与浮重结合法测定烘干膜和冻干膜的孔隙率分别约为70%和90%. 由于细菌纤维素含有大量的羟基, 故烘干膜表现出极好的透湿性. 将细菌纤维素膜分别与成纤维细胞和软骨细胞进行复合培养, 并将成纤维细胞和细菌纤维素膜的复合物进行裸鼠皮下移植实验. 结果显示, 移植的复合物很好地融入了裸鼠正常皮肤, 成纤维细胞和软骨细胞在细菌纤维素表面形成连续的细胞层, 绿色荧光蛋白表达正常. 以上结果表明, 细菌纤维素膜非常适合细胞贴附和增殖, 表现出较好的生物相容性, 有望成为新型组织工程支架材料.

骨髓间充质干细胞对大鼠胰腺损伤的修复

背景:胰腺缺血性损伤是临床常见但又难以解决的实际问题,常规的预防和治疗方法收效甚微。骨髓间充质干细胞是近年来兴起的治疗损伤公认有效的手段,因此,有必要寻找利用干细胞治疗缺血性胰腺损伤的方法。目的:观察骨髓间充质干细胞对胰腺缺血损伤的修复作用。方法:采用贴壁培养和组织块培养相结合的方法得到高纯度的骨髓间充质干细胞,在含体积分数为20%胎牛血清的L-DMEM培养液中扩增培养,传3代后用增强型绿色荧光蛋白重组腺病毒标记细胞,注入胰腺缺血性损伤动物模型胰腺局部,观察动物存活率,冰冻切片共聚焦显微镜观察标记细胞位置。结果与结论:实验分离获得了高纯度贴壁生长的骨髓间充质干细胞。注入细胞的动物模型存活率明显高于对照组;共聚焦显微镜观察显示,注入细胞24h后,细胞可到达受损部位,并聚集在微循环系统中,以后逐渐大量进入受损部位,在循环系统及导管系统中有较高表达。提示采用骨髓间充质干细胞局部注入,可明显增加模型动物的存活率,有利于损伤的胰腺修复。

人参皂苷Rh3对人结肠癌细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨人参皂苷Rh3对人结肠癌细胞SW480增殖与凋亡的影响。方法体外培养的人结肠癌细胞SW480分别用无血清培养液稀释的终浓度为15、30、60、120和240μg/ml的人参皂苷Rh3作用24、48及72h,应用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞增殖;采用终浓度为15μg/ml的人参皂甙Rh3作用于SW480细胞24及72h,应用原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,采用终浓度为15、20μg/ml的人参皂甙Rh3作用于SW480细胞24及72h;应用丫啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双染法计算细胞凋亡率和坏死率。结果 15μg/ml人参皂苷Rh3作用48h即可明显抑制SW480细胞增殖,其作用随剂量增加和作用时间延长而增强,30μg/ml人参皂苷Rh3作用72h抑制率超过80%;15μg/ml人参皂苷Rh3作用24h部分细胞凋亡,胞浆呈棕色,作用72h凋亡细胞增多;15μg/ml人参皂苷Rh3作用24h细胞凋亡率为25.5%,20μg/ml人参皂苷Rh3作用24h细胞凋亡率为31%,未见细胞坏死,15μg/ml人参皂苷Rh3作用72h细胞凋亡率为55%、坏死率为7%,20μg/ml人参皂苷Rh3作用72h细胞凋亡率为67.5%、坏死率为7%。结论人参皂苷Rh3能抑制人结肠癌细胞SW480增殖,诱导其凋亡,作用呈剂量依赖性和时间依赖性。

重组pcDNA3.1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达

目的:将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中,观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。方法:实验于2003-08/2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只,兔膝关节软骨切碎后取2.0～2.5kg软骨组织,进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物,复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418400mg/L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞,显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d,分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westernblot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。结果:①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况:家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶/Ⅱ型胶原酶进行消化,能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h,部分细胞开始贴壁生长,72h后分裂增殖,7d时细胞融合率为90%～100%。贴壁初期细胞呈圆形或三角形,以三角形为主,每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况:转染后的软骨细胞用G418筛选,4d转染效率约15%,阳性克隆细胞七八天融合率约为90%。G418连续筛选28d,阳性克隆细胞仍然存活,细胞融合率为100%。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞,G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果:聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,结果在1.3kb处可见DNA条带,作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果:在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Westernblot检测结果:可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果:转染7,28d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光,未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达。⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果:转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7,28d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色,未转染的软骨细胞未见BMP7表达。结论:用脂质体将pcDNA3.1-BMP7DNA质粒转染至兔关节软骨细胞,BMP7在关节软骨细胞中获得表达,为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础。

表皮生长因子及胶原网架对培养成纤维细胞的影响

目的:观察表皮生长因子(EGF)及胶原网架对体外培养的皮肤成纤维细胞(FB)增殖的影响。方法:酶消化法分离大鼠皮肤FB,以含有10%新生牛血清的DMEM培养液进行培养,采用细胞计数、MTT法、组织学方法测定细胞增殖能力和形态变化。结果:培养液中EGF浓度大于5μg.L-1时,FB的增殖活性随EGF浓度的增加而增加,在20μg.L-1浓度时达到最大。植入胶原网架中的FB,随着培养时间的延长,细胞数量增加缓慢。结论:EGF对FB的增殖具有促进作用,而胶原网架对FB的增殖速率具有一定的调节作用。

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的:观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导入正常真皮成纤维细胞后,能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子,为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。方法:实验于2001-06/2005-06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3.0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3.0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3.0-hVEGF165质粒大量制备(碱裂解法)→质粒纯化→质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只,无菌条件下取新生兔皮肤,尽量去除皮下组织,切成宽0.3cm小条块,Ⅰ型胶原酶消化,进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞,经G418筛选,获得阳性转染细胞克隆,并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平;原位杂交显示转基因细胞内VEGF165mRNA的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。结果:①质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5.4kb和0.57kb两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3.0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况:共进行15次转染试验,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达:pcDNA3.0-hVEGF165转染成纤维细胞后,24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋白表达,高达(3280±2054)ng/L,并于48,72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果:转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGFmRNA。G418应用2～4周后,可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆,筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEGFmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测:转染后成纤维细胞S期细胞比例增加,G1和G2期细胞减少,表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高,转染前为1.26%,转染后2d为2.64%,至12代时高达17.35%。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察:细胞表面有较多微绒毛,核呈不规则形,胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体,沿膜可见一些膜包被颗粒。结论:真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165成功导入家兔皮肤成纤维细胞,在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子,在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。

应用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨

目的:利用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨,测定BMP7基因在构建的组织工程软骨中的表达,探讨与未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨的生物学差异。方法:实验于2004-06/2005-01在哈尔滨医科大学附属第二医院临床药学药物研究所完成。应用转染重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒并用G418筛选14d的阳性克隆软骨细胞,以胶原-纤维蛋白凝胶为支架,构建转BMP7基因组织工程软骨。以未转BMP7基因组织工程软骨作为对照,软骨细胞的接种密度为5×109L-1。用甲苯胺蓝、苏木精-伊红染色对组织工程软骨培养物组织学分析;原位杂交法检测Ⅱ型胶原mRNA的表达;透射电镜观察组织工程软骨培养物的超微结构;原位杂交和免疫组化法测定体外培养物BMP7mRNA和蛋白的表达。结果:①BMP7基因转染软骨细胞情况:G418筛选7d时大量细胞死亡,约30%的细胞存活,且贴壁生长。G418连续筛选14,28d均有阳性克隆细胞生成,贴壁生长率100%,存活的阳性克隆细胞为转染成功的软骨细胞。②组织工程软骨培养物大体形态及显微镜观察结果:构建的组织工程软骨培养物呈浅粉红色胶冻样圆盘状,透明,体积约为16mm×16mm×3mm。显微镜下只能观察到呈圆形的浅层细胞。③组织工程软骨培养物组织学分析结果:组织工程软骨培养物体外培养7,14,28d,细胞周围有丰富的细胞外基质,转BMP7基因组织工程软骨培养物细胞基质较多,体外培养14d软骨细胞合成和分泌最为活跃。④组织工程软骨培养物Ⅱ型胶原表达mRNA原位杂交检测结果:软骨细胞核周围呈棕黄色,有mRNA表达。⑤不同培养时间下组织工程软骨培养物DNA含量的测定情况:DNA含量随着培养时间的推移逐渐增加,21d时达到高峰,转BMP7基因比未转染BMP7基因的组织工程软骨培养物DNA含量高(P<0.05)。⑥不同培养时间下组织工程软骨培养物糖胺多糖含量的测定情况:转BMP7基因组织工程软骨培养物体外培养14d时糖胺多糖含量最高,且各时间点糖胺多糖含量均高于未转BMP7基因组织软骨培养物(P<0.05)。⑦组织工程软骨培养物的超微结构观察:与未转BMP7基因组织工程软骨培养物比较,体外培养7d,转BMP7基因组软骨培养物内软骨细胞细胞器发达,内质网、线粒体和高尔基体相对较丰富,细胞基质合成较旺盛;体外培养21d,转BMP7基因组织工程软骨培养物中软骨细胞粗面内质网仍较发达,线粒体和高尔基体相对减少,细胞基质合成能力减弱。⑧BMP7mRNA表达原位杂交测定结果:体外培养7,14,21d,转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7mRNA表达,而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7mRNA。⑨BMP7蛋白表达免疫组化测定结果:体外培养7,14,21d,转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7蛋白表达,而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7蛋白。结论:成功构建转BMP7基因组织工程软骨,其生物学特性优于未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨,作为移植物修复软骨组织缺损具有一定的可行性和优越性。

饮水型氟中毒病人血、发、指甲、尿中氟及有关元素的测定

饮水型氟中毒是由于饮水中氟含量过高,超过机体的耐受量而引起的一种慢性中毒性地方病。该病病情一般与饮水氟含量正相关,然而有的病区并非完全如此,饮水氟含量相近时,发病率相差都很大,其原因和机理尚未完全阐明。

结直肠癌细胞外泌体的制备及其促单核细胞增殖作用

目的:从结直肠癌细胞系中分离鉴定外泌体,初步研究结直肠癌来源的外泌体潜在的免疫学特性,为外泌体在结直肠癌免疫学治疗中的应用提供依据。方法:超速离心法从HCT116和SW480 2种结直肠癌细胞系培养上清中分离提取正常细胞外泌体和热休克细胞外泌体,进一步用220nm的滤膜进行纯化获得纯度较高的外泌体。采用透射电镜观察所提取外泌体表征形态,聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析细胞和外泌体的蛋白组成,检测外泌体促进外周血单个核细胞(PBMCs)的增殖功能。结果:透射电镜下正常的外泌体和细胞热休克获得的外泌体形态相近,均呈现典型的圆形或椭圆形外泌体结构,直径为50～100nm。聚丙烯酰胺凝胶电泳,结直肠癌细胞裂解物与结直肠癌细胞系来源外泌体的蛋白组成不同,与未处理和经热休克处理的结直肠癌细胞比较,外泌体对PBMCs的增殖有更强的促进作用(P<0.05),热休克作用可使外泌体诱导的PBMCs的增殖程度显著升高(P<0.05)。结论 :超速离心法和滤膜过滤方法可有效地从结直肠癌细胞系中提取外泌体,细胞裂解物和外泌体的蛋白组成差异可能是造成免疫学特性差异的主要原因,将细胞经热休克处理可增强外泌体的免疫原性。

细菌纤维素构建组织工程角膜基质的方法及其评价

目的:探讨以细菌纤维素(BC)为支架构建组织工程角膜基质的可行性。方法:体外分离培养兔和人角膜基质细胞,种植到BC膜中,构建完成后进行兔和人角膜基质细胞-BC复合膜的生物检测,并将兔角膜细胞生物复合物进行同种异体移植。术后1、4和8周时分别活体行前节OCT、角膜共焦显微镜检查,离体后组织学及免疫组织化学检查。结果:人和兔角膜基质细胞长入BC的网架结构,细胞生长状态良好。移植术后1周兔眼无炎症反应及新生血管,4周后植片边缘出现新生血管,表面无水肿及溃疡形成。术后8周角膜共焦显微镜显示:移植片周围基质细胞增生活跃,邻近的角膜内皮细胞数量和形态正常。前节OCT显示:移植后复合膜逐渐降解,4周时复合膜边界模糊,8周时密度接近正常角膜组织。离体组织学检查显示:BC复合膜与正常角膜基质相似,有炎细胞浸润和血管形成,角膜组织无坏死和溶解。结论:BC无细胞毒性,具有良好的组织相容性和可降解性,可作为构建组织工程角膜基质的生物支架。

壳多糖组织工程支架材料的制备及其应用

目的:探索一种简单的制备壳多糖细胞外基质网架的方法,考察该基质网架作为组织工程支架材料应用的可行性。方法:壳多糖溶于乙酸,搅拌成均匀泡沫状,冷冻铸型制成海绵状多孔基质网架。利用光镜、电镜等方法测定该网架的孔径和空孔率。分别应用该网架构建复层组织工程皮肤和组织工程软骨。结果:制备的壳多糖网架外观呈多孔海绵状,光镜下观察有大小不等的孔隙;扫描电镜下观察,网架错综相连成许多网孔,孔径为83～136μm,平均孔径为110μm,平均三维空孔率为78%。构建的复层组织工程皮肤具有与天然皮肤极为相似的表皮和真皮双层结构,皮肤角朊细胞和成纤维细胞贴附于网架生长、增殖,形成连续的细胞层,细胞层数增多明显,并分泌角质样物质和基质样物质,网架逐渐降解。软骨细胞在网架上贴附、增殖良好,并分泌细胞外基质;组织学观察有新生软骨组织形成。结论:制备的壳多糖细胞外基质网架具有一定的孔径和空孔率,适于细胞贴附生长和增殖,将其作为组织工程支架材料具有较好的应用前景。