荆芥HD-Zip基因家族的全基因组鉴定及分析

【目的】鉴定荆芥Schizonepeta tenuifolia的HD-Zip基因家族,利用生物信息学方法分析其在全基因组中的分布和相关特征以及在不同时期中的表达规律,为该家族基因的进一步研究奠定基础。【方法】根据已经表征的HD-Zip基因,筛选荆芥基因组内的HD-Zip基因序列,利用MEME、PlantCARE、NCBI、MEGA X、MCScanX、Circos等在线网站及软件对蛋白序列进行基本理化性质分析、进化树构建、染色体定位、基因结构分析、共线性基因分析等。【结果】在荆芥全基因组中共鉴定到42条HD-Zip基因序列,它们可被分为4个亚家族,分别含有16、7、5、14个基因,亚家族之间的基因长度、结构及保守基序差异显著,但在亚家族内部保守,荆芥基因组与拟南芥Arabidopsis thaliana基因组共线性分析发现有37对基因,可能具有相似的生物学功能。荆芥的4个亚家族基因的顺式元件中均高频出现了光响应、脱落酸响应、MeJA响应等元件,在不同生长时期的叶片及部位的转录组数据中具有不同的表达趋势,Ⅰ亚家族主要在幼叶中表达,Ⅱ和Ⅲ亚家族主要在根中在表达,Ⅳ亚家族主要在叶中表达。【结论】在荆芥基因组中共获得42条HDZip基因序列,被分为4个亚家族(HD-ZipⅠ~Ⅳ),亚家族内部高度保守,亚家族之间差异显著,其基因结构、保守结构域及表达模式不同。亚家族Ⅰ和Ⅱ,亚家族Ⅲ和Ⅳ亲缘关系更近,HD-Zip基因具有组织表达差异性,协同调控了荆芥的生长发育和次生代谢。

鱼精蛋白与[Co（phen）3]^3＋间相互作用的电化学研究及分析应用

研究了鱼精蛋白与[Co（phen）3]^3＋间的相互作用，并以[Co（phen）3]^3＋作为指示剂进一步研究了鱼精蛋白的电化学检测．结果表明，鱼精蛋白与[Co（phen）3]^3＋间存在明显的相互作用，随着鱼精蛋白的加入，[Co（phen），]“在ITO电极上的氧化峰电位正移，还原峰电位线性地负移，氧化还原峰电流线性地减小，线性区间为5×10^-6-1×10^-3g/L，检测限为2．0×10^-6g／L．该鱼精蛋白传感器操作简单，具有较好的选择性，抗尿液的干扰．

不同品种龟甲的光谱学特征研究

目的研究不同基原物种龟甲的光谱学特征。方法对4个基原物种的龟甲进行近红外光谱、红外光谱、拉曼光谱的谱学信息测定。结果拉曼光谱1298.50 cm^(-1)、1230.77 cm^(-1)、1245.49 cm^(-1)波段的酰胺Ⅲ带C—N振动峰表明乌龟、巴西龟与中华花龟、黄喉拟水龟之间具有特征差异,红外二阶导数谱图表明4种龟甲在1238.26~1202.61 cm^(-1)、959.57~944.35 cm^(-1)波段有峰形差异,二维相关红外光谱表明依据1800~1300 cm^(-1)波段自动峰可以区分4种样品;近红外光谱的FD+Con+Ctr建模处理可区分正伪品龟甲。结论光谱特征分析表明不同物种的龟甲化学成分类型相近,依据酰胺吸收带特征峰能够反应龟甲的品种差别。

霍山石斛β-1,4-木糖基转移酶(IRX9)基因克隆及生物信息学分析

目的克隆霍山石斛β-1,4-木糖基转移酶(IRX9)基因,并进行生物信息学、密码子偏性分析。方法根据霍山石斛转录组数据获得的IRX9基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术得到IRX9基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析。结果霍山石斛IRX9基因全长1 553 bp,包含一个长度为1 047 bp的开放阅读框,编码348个氨基酸,理论相对分子质量为39 350,等电点为7.26,为不含信号肽的亲水性稳定蛋白,定位于质膜,具有多个磷酸化位点和糖基化位点。系统进化树表明,该序列与同科植物铁皮石斛的同源性最高,且具有GT-A超家族的保守区域"DXD"。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有27个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论成功克隆IRX9基因,为从分子水平调控霍山石斛的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础。

大叶蛇葡萄无色花色素还原酶基因的克隆及其序列分析

无色花色素还原酶(LAR)是植物类黄酮合成途径中一个关键酶。本研究根据大叶蛇葡萄转录组测序得到了无色花色素还原酶(LAR)基因序列,通过RT-PCR技术克隆得到LAR基因cDNA全长,并对该序列进行生物信息学分析。结果表明:大叶蛇葡萄LAR基因cDNA全长为1 267 bp,包含一个长度为1 170 bp的开放阅读框,编码389个氨基酸,理论蛋白分子质量为42.38 kD,等电点为7.73。氨基酸多序列比对发现,该序列与同科植物葡萄等具有较高的同源性。生物信息学分析表明LAR为亲水性蛋白,不含信号肽,很可能定位于细胞质。本研究为进一步研究LAR基因的功能,阐明该基因在大叶蛇葡萄类黄酮合成路径中的作用提供了新的线索。

荆芥StHD1与StHD8基因克隆与调控腺毛的功能分析

HD-Zip是植物界一类特有的转录因子,影响植物的生长发育及次生代谢。其中的HD-ZipⅣ被认为在毛状体的发育中具有重要的调控作用。为了探究荆芥HD-ZipⅣ亚家族的2个基因StHD1与StHD8在荆芥腺鳞中的调控作用,利用转录组测序技术、酵母双杂技术等对2个基因的表达模式、蛋白之间的互作进行了分析,并对基因进行了亚细胞定位、在烟草体内和荆芥体内的功能验证。结果表明:荆芥的StHD1与StHD8与其他植物的HD-ZipⅣ亚家族蛋白序列相似性较高,具有HD-ZipⅣ亚家族特征保守结构域,亚细胞定位显示被定位于细胞核;以上2个基因主要在幼嫩组织和花穗中表达;酵母双杂结果表明StHD1与StHD8蛋白之间存在互作。StHD1与StHD8过表达的转基因烟草腺毛密度和长度明显增加。通过VIGS(virus-induced gene silencing)技术在荆芥体内抑制StHD1与StHD8表达会导致腺鳞密度、单萜合成关键基因表达量下降,单萜主要成分柠檬烯和胡薄荷酮相对含量降低。以上结果表明,荆芥的StHD1与StHD8通过形成复合体对荆芥的腺毛具有调控作用,同时影响单萜的生物合成。

荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆及生物信息学分析

目的克隆荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,StDXS)基因,并进行生物信息学分析。方法根据荆芥转录组数据获得的StDXS基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得StDXS基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析。结果荆芥StDXS基因全长2177 bp,包含一个长度为2157 bp的开放阅读框,编码718个氨基酸,其理论相对分子质量为77240,等电点为6.32,定位于叶绿体,不存在跨膜区及信号肽,为非分泌蛋白。同源系统进化树分析表明,该序列与同科植物鼠尾草的DXS基因进化关系较近,均属于DXS1亚家族。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有28个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论成功克隆荆芥StDXS基因并进行生物信息学分析,为从分子水平调控荆芥的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础。

芡叶类黄酮-3'-羟化酶(F3'H)基因表达分析及功能验证

芡叶中含有丰富的花青素,花青素合成是类黄酮合成路径重要分支之一,其中类黄酮-3'-羟化酶(F3'H)可参与生成花青素合成所需的重要的中间产物。该研究依据芡Euryale ferox叶转录组数据,克隆获得芡叶F3'H的cDNA序列,命名为EfF3'H。通过生物信息学与qRT-PCR技术检测EfF3'H在芡的不同栽培种及不同时期基因表达,进而分析该基因与黄酮类物质合成的相关性,并通过真核表达系统验证了EfF3'H的生物学功能。结果显示,EfF3'H包含长1566 bp开放阅读框,编码521个氨基酸,属亲水性跨膜蛋白,预测定位于细胞质膜,结合保守结构域预测分析,该蛋白属于细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)家族;qRT-PCR结果表明,EfF3'H表达在不同栽培种之间具有显著差异性,且其表达水平与芡叶中的相关类黄酮物质含量呈高度相关性。真核表达研究表明,EfF3'H蛋白具有将山柰酚转化为槲皮素的生物活性。该研究首次克隆了芡中EfF3'H的cDNA序列,并验证了其生物功能,为进一步开发芡叶资源提供科学依据,同时为进一步解析药用植物中黄酮类物质的生物合成途径奠定了基础。

不同产地大叶蛇葡萄多糖含量测定及抗氧化活性的研究

目的比较不同产地大叶蛇葡萄的多糖含量以及体外抗氧化活性,为大叶蛇葡萄品质评价及资源开发提供科学依据。方法采用回流法提取不同产地的大叶蛇葡萄多糖,蒽酮法测定多糖含量,DPPH·、ABTS+·法进行多糖体外抗氧化活性检测。结果来凤县格勒乡小何村1组多糖的含糖量最高,为2.22%;土家寨村2组多糖含量最低,为1.05%。此外,小何村1组多糖对DPPH·和ABTS+·的清除效果最好。结论不同产地间大叶蛇葡萄多糖含量与自由基清除能力差异较大。

大叶蛇葡萄类纤维素合成酶基因的克隆及其序列分析

目的:从药用植物大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophylla中克隆得到类纤维素合酶(Cellulose synthase-like,Csl)基因(Am Csl)全长,并对序列进行生物信息学分析。方法:根据大叶蛇葡萄A. megalophylla转录组测序数据得到的Am Csl基因序列设计特异引物,以嫩叶总RNA逆转录的c DNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增Am Csl基因全长,并进行TA克隆测序,利用多种软件对该序列进行生物信息学分析。结果:Am Csl全长c DNA为1 438 bp,包含1个561 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码186个氨基酸,蛋白质分子式为C1011H1547N233O257S10,理论相对分子质量为22. 40 k Da,理论等电点(PI)为7. 59,脂肪族指数(AI)为116. 88,存在跨膜区,无信号肽,可能定位于内质网膜,平均疏水系数为0. 670,不稳定指数为42. 56,属于疏水性不稳定蛋白,保守结构域包含了1个纤维素合成酶超家族结构域,二级结构以α-螺旋为主。氨基酸多序列比对和系统进化树分析发现,Am Csl与同科植物葡萄有较高的同源性。结论:获得了大叶蛇葡萄Am Csl基因的全长,对其进行了初步的生物信息学分析,为进一步研究大叶蛇葡萄多糖的积累和生物合成的调控奠定了必要基础。

荆芥柠檬烯-3-羟化酶基因克隆及生物信息学分析

目的:克隆荆芥(Schizonepeta tenuifolia)中的柠檬烯-3-羟化酶基因(limonene-3-hydroxylase,StL3OH),并对该基因的cDNA序列进行生物信息学分析。方法:根据荆芥转录组数据库设计特异性引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆StL3OH基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析。结果:荆芥StL3OH基因的cDNA序列长为1 598 bp,包含1个长度为1 497 bp的完整开放阅读框,编码498个的氨基酸,其StL3OH蛋白理论相对分子质量为56.40 kDa,为亲水性不稳定蛋白。生物信息学分析表明,StL3OH蛋白无信号肽,具有1个跨膜区,可能定位于内质网膜上。多重序列比对和聚类分析表明,荆芥StL3OH蛋白与植物留兰香柠檬烯-3-羟化酶蛋白(MsL3OH)的氨基酸序列高度相似,均含有细胞色素P450血红素结合区,属于细胞色素CYP71家族中的D亚家族。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C)结尾的密码子,具有27个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论:首次从荆芥中克隆得到StL3OH基因的cDNA序列,为下一步研究StL3OH蛋白的结构与功能和该基因在荆芥单萜类成分的累积与生物合成的调控机制提供依据。

大叶蛇葡萄类黄酮-3'-羟化酶基因(F3'H)的克隆及生物信息学分析

类黄酮-3’-羟化酶(F3’H)是黄酮化合物生物合成过程中的关键酶之一,本研究从大叶蛇葡萄转录组数据库中筛选出类黄酮-3’-羟化酶基因(F3’H),利用RT-PCR等技术克隆了其全长序列,并分析F3’H基因编码蛋白的理化性质和结构特征。结果表明,该序列全长为1718 bp,开放阅读框(ORF)长度为1530 bp,相对分子质量为55.89 kD,编码509个氨基酸,等电点为7.3,分子式为C2(513)H3974N696O705S21,不稳定指数为38.26,为稳定蛋白;脂肪族指数为96.42,总平均疏水性为-0.004,为亲水性蛋白;具有多个磷酸化位点,有信号肽,存在一个跨膜区,亚细胞定位于内质网膜,二级结构以α-螺旋为主。系统进化分析和多重序列比对表明该序列与藤茶的亲缘关系最近。密码子偏性分析表明该基因以G/C结尾的密码子使用频率较高,最适合该基因的异源表达宿主是大肠杆菌。本研究结果为进一步研究大叶蛇葡萄F3’H蛋白功能,以及揭示该植物中具生物活性的黄酮类成分的生物合成机制提供了一定的基础。