猪精液冷冻技术的研究

以解冻后的精子活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和人工授精结果为判定指标 ,比较了几种冷冻稀释液、解冻液及冷冻 -解冻程序对猪精液冷冻的效果 ,并对所筛选出的最佳稀释液和冷冻程序做了改进。结果如下 :(1) 号稀释液冷冻解冻后的精子活力 (32 .4± 7.3) %、活率 (4 2 .2± 3.2 ) %、顶体完整率 (6 2 .3± 0 .8) %和弯尾率 (4 2 .6± 7.5 ) %均显著高于 、 、 号稀释液 (P<0 .0 5 )。 (2 )在 号稀释液中添加 0 .5 %、1%和 2 %的 O.E.P(氨基 -钠 -十二烷硫酸酯 )使精子活率提高 5 %、弯尾率提高 6 %、顶体完整率提高近 10 % ,与对照组相比差异显著 (P<0 .0 5 )。 (3)应用改进的稀释液 ( 液加 1% O.E.P) ,细管法比颗粒法冷冻精子活率提高近 7个百分点 ,活力提高 6个百分点 (P<0 .0 5 )。(4 )室温预平衡 4h的精子活力和活率都比对照组 (0 h)有显著提高 (P<0 .0 5 ) ,而预平衡 2、6 h的精子活力和活率与对照组差异不显著 (P>0 .0 5 )。 (5 ) 号解冻液解冻后精子活力 (4 2 .9± 2 .6 ) %显著高于 、 、 号解冻液 (P<0 .0 5 )。 (6 )用 5 0℃水浴解冻精子的活力 (4 6 .3± 2 .6 ) %显著高于 39℃ (4 2 .9± 2 .6 ) %和 70℃水浴 (4 1.1± 5 .7) %解冻的精子活力 (P<0 .0 5 )。 (7)精清和 号解冻液?

肝素处理山羊精子体外获能的研究

系统研究了作用浓度、时间和温度以及输卵管上皮细胞和卵丘细胞对肝素处理山羊精子体外获能后的精子活力、质膜完整性、顶体完整率、获能比例及受精和卵裂的影响 ,为改善山羊精子体外获能效果和研究获能机理提供了必要的数据。主要实验结果如下 :1 在获能液中添加 5、10、2 5、50和 10 0 μg mL肝素处理 45min时 ,添加 50和10 0 μg mL肝素精子获能比率最高 (分别为 55%和 56% ) ,但添加 10 0 μg mL肝素处理后顶体完整率明显 (P <0 0 5)低于对照组。说明山羊精子获能的最佳肝素浓度为 50 μg mL。 2 随肝素作用时间 (0 ,10 ,2 0 ,3 0 ,45,60和 12 0min)的延长 ,获能精子比例逐渐提高。其中 ,肝素处理 45～ 12 0min各组的获能精子比例差异不显著 (P >0 0 5) ,处理12 0min组的精子活力和质膜完整率显著低于其它各组。说明 50 μg mL肝素处理精子获能的最佳时间是 45～ 60min。 3 在 42℃和 3 8 5℃下处理时 ,获能精子比例显著高于 15℃和 3 7℃ ,但 42℃处理后精子活力和顶体完整率显著低于其它温度。因此 ,3 8 5℃为山羊精子获能的最佳温度。 4 与输卵管上皮细胞共培养获能精子比例显著高于对照组和卵丘细胞组 ,但精子活力、质膜完整率和顶体完整率差异不显著。输卵管上皮组的受精率 (91 3 % )和卵?

影响山羊体外受精的因素

以屠宰山羊卵母细胞为材料研究了公羊个体、附睾不同部位精子、成熟培养和受精时卵丘存在与否、卵丘扩展程度及卵龄对山羊体外受精的影响。结果表明 :1)不同公羊精液在受精、卵裂和桑椹 /囊胚率上都有显著差异 ;2 )附睾尾精子和鲜精的受精、卵裂和桑椹 /囊胚率无显著差异 ,但显著高于附睾体和附睾头精子 ;3)成熟培养 2 4和 2 7h卵母细胞的的桑椹胚 /囊胚率显著高于培养 2 1和 30h卵母细胞 ;4 )卵丘扩展 3和 4级卵母细胞受精和桑椹胚 /囊胚率显著高于扩展 0和 1级卵母细胞 ;5 )成熟培养前机械去卵丘严重影响卵母细胞体外受精和桑椹胚 /囊胚率 ;6 )受精前完全去掉卵丘显著影响桑椹胚

N-乙酰半胱氨酸对玻璃化冻存小鼠GV期卵母细胞成熟和后续胚胎发育能力影响

冷冻保存后的GV期卵母细胞内大量积累ROS,影响胚胎发育。NAC作为一种抗氧化剂,可缓解氧应激造成的损伤。但NAC对冷冻GV期卵母细胞是否存在维持作用尚待研究。为探究NAC在冷冻、解冻后小鼠GV期卵母细胞发育中作用,检测冷冻保存后小鼠GV期卵母细胞在添加不同浓度NAC成熟培养液后成熟情况,观察其卵裂率与囊胚率、线粒体分布、ROS水平和受精后胚胎发育等。结果表明,添加1.5 mmol·L^(-1)NAC,冷冻保存后,小鼠GV期卵母细胞,线粒体排布均匀,卵母细胞比例显著提高,ROS水平降低。NAC可改善小鼠GV期卵母细胞经冷冻保存后复苏和体外成熟水平,提高其发育能力。

精子和卵母细胞质量控制对山羊卵胞质内精子注射(ICSI)受精的影响

以体外成熟卵母细胞为材料研究了精子来源及制动处理方法、卵母细胞质量及注射后激活等因素对山羊ICSI效果的影响。结果说明,附睾头、体和尾精子ICSI后的受精率、卵裂率和桑椹胚/囊胚发育率与射出的鲜精精子都没有明显差异(p>0.05),但带下注射时附睾头和体精子的受精和发育率显著低于附睾尾和射精精子。在以4种不同方法致死的精子中,室温保存24h的死精子ICSI受精、卵裂和桑椹/囊胚率虽然低于对照组,但是明显高于其它方式致死的精子;5℃保存15天的死精子受精和发育效果最差。0.0005%Triton X-100处理精子的受精率、卵裂率和桑椹/囊胚率显著(p<0.05)高于制动对照组、不制动对照组和其它浓度组。经高渗处理法检测质量好的卵母细胞ICSI受精和胚胎发育效果显著好于质量差的卵母细胞。与对照组相比,A23187和Ionomycin/6-DMAP激活处理均显著(p<0.05)提高ICSI的受精率、卵裂率和桑椹/囊胚发育率。因此,精子在附睾内的成熟过程主要与其获得与卵质膜融合能力有关;精液保存方法对精子受精能力的损伤程度有很大差异;适当浓度的Triton X-100处理可模仿精子制动;卵母细胞质量是影响ICSI效果的重要因素;注射精子后激活卵母细胞能保证山羊ICSI的受精效果。

猪精子体外获能后其质膜完整性的影响

精子质膜功能和结构的完整性对于精子的受精能力十分重要.常规检测,例如曙红染色仅能检测质膜的结构完整性,不能评价质膜的功能性.

哺乳动物精子检测技术研究进展

普通光学显微镜检测精液存在主观性、可变性、分析的精子数量少和与受精能力相关性差等缺点。近些年来,一些新的技术用于检测精子,可以更加细致地评价精子的特性。荧光染色技术可以用于评价精子的特殊性质和功能,包括质膜完整性、获能状态和顶体状态。联合使用荧光染料,可以同时检测精子几种功能特点。流式细胞仪可以在短时间内分析大量的经荧光标记的精子。计算机辅助精子分析系统可以提供精子活力和形态学上客观的和详细的信息。通过检测精子与透明带或者输卵管上皮附着、精子穿透卵母细胞,可以获得精子受精能力的信息。未来的研究方向仍是寻找有效的预测精子受精能力的参数。

不同物种成熟精子Fas蛋白的表达研究

使用免疫荧光标记和激光共聚焦显微镜方法,对不同物种成熟精子Fas蛋白进行观测。明确细胞凋亡蛋白Fas在不同物种成熟精子表面的分布规律,并对Fas蛋白进行定位。结果显示Cy3红色荧光标记的Fas蛋白主要分布在啮齿类动物(大鼠、小鼠),反刍动物(山羊、绵羊、牛)的精子头部和中段线粒体鞘上,而在猪和人的成熟精子上未检测到Fas蛋白。说明使用激光共聚焦显微镜技术可以精确定位标记后的Fas蛋白,不同物种成熟精子Fas蛋白的表达存在差异。

镁离子对小鼠卵母细胞电激活效果的影响

为探索镁离子对卵母细胞激活的作用 ,研究了电激液、操作液和培养液中镁离子对小鼠卵母细胞电激活效果的影响。注射 h CG后 18h获取的小鼠卵母细胞 ,在含有或不含有 Mg2 + 的电激液、操作液和培养液中进行电刺激、洗涤和培养 ,并于培养 6 h和 9h后分别检查原核形成情况。结果发现 ,当用既含钙又含镁离子的甘露醇 (PM)进行电刺激 ,用含 Mg2 +的 M2 (M2 )和 Whitten′s液 (WM)进行洗涤和培养时 ,卵母细胞激活率为 6 7.4 % ,而当电激液为不含 Mg2 +甘露醇 (PM- )时 ,激活率降至 5 1.3% ,2组间差异显著 (P<0 .0 5 )。用 PM-电刺激 ,以 M2或不含有 Mg2 + 的 M2 (M2 - )洗涤并用 WM或不含有 Mg2 +的 Whitten′s(WM- )培养 6 h,卵母细胞激活率分别为 5 0 .0 %、4 9.6 %和 5 3.8% ,3者间差异不显著 ,但显著 (P<0 .0 5 )低于用 PM、M2和 WM处理的对照组的激活率 (72 % )。培养 9h检查时 ,3个处理组的激活率均显著 (P<0 .0 5 )增加 (分别增加了 16 .7%、19.2 %和 18.2 % ) ,而对照组的激活率增加不明显 (5 % )。这些结果说明 ,电激液中的 Mg2 + 对卵母细胞的电激活率和原核形成速度有明显的促进作用 ,而操作液和培养液中的 Mg2 +

不同浓度二甲双胍对猪精液液态保存效果的影响

[目的]研究不同浓度二甲双胍对猪精液液态保存效果的影响。[方法]在猪精液液态保存液中分别添加不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L)的二甲双胍,测定不同保存时间精子的活力、活率、质膜完整率、顶体完整率等指标。[结果]猪精液液态保存第3天,在不同浓度二甲双胍作用下各组间精子活力出现差异。第5天,添加1.0 mmol/L二甲双胍的保存液保存的精子活力达到38.03%,精子活率为49.03%,质膜完整率为43.91%,顶体完整率为50.88%,均高于对照组。[结论]添加二甲双胍有助于提高液态保存猪精液的质量,延长保存时间。

改进山羊超数排卵方法的研究

实验以黑龙江地方山羊为实验材料 ,应用国产激素研究了单纯使用 FSH和 FSH结合PMSG,以及氯前列烯醇 (PG)和孕酮 (Pr)的超排和发情同步效果。结果显示 ,单纯用 FSH处理的山羊 (N=6 )平均排卵 6 .83± 1.19个 ,平均获卵 5.83± 1.0 1个 ,获卵率在 85.30 % ;用 FSH结合 PMSG处理的母羊 (N=17)平均排卵 13.94± 1.11个 ,平均获卵 10 .59± 0 .97个 ,获卵率为 78.2 0 % ;t检验证明 ,两种处理山羊的排卵和获卵数差异均显著 (P <0 .0 5) ;说明 FSH与PMSG联合使用大大提高了山羊的排卵和获卵数。尽管 PG和 Pr两种同步发情方法都使山羊在开始超排处理后 72到 96 h之间发情 ,但用 PG处理的超排山羊 (N =2 0 )发情时间更为集中 ,大多数 (70 % )都于注射 PG后 2 4～ 30 (开始超排处理后 72～ 78) h开始发情。注射 h CG(发情 )后2 4～ 30 h,70 %以上的卵母细胞都具有第一极体 ,为新排的卵母细胞 ;到 h CG后 36～ 4 0 h,只有不到 4 0

卵丘颗粒细胞核移植克隆猪的初步研究

经颗粒细胞核移植已成功获得克隆小鼠(Wakayamaetal.1998,Nature394:369)。在牛,卵丘颗粒细胞核移植胚胎也已经发育到囊胚期(Collasetal.1994,MolReprodDev38:264)。然而,目前在猪尚未见到有关颗粒细胞核移植成功的报道。为此,我们进行了颗粒细胞核移植培育克隆猪的研究。...

Myostatin通过Smad3下调MyoD的表达来抑制骨骼肌卫星细胞的分化

Myostatin基因,是肌肉生长的负调控因子,通过下调MyoD的表达抑制骨骼肌细胞的分化,但具体机制目前尚未完全清楚。以体外培养的猪骨骼肌卫星细胞为实验材料,利用RNA i技术,以Smad3为靶基因进行干扰研究,研究干扰前后猪骨骼肌卫星细胞增殖情况的变化以及MyoD、Myostatin基因的表达规律,进一步阐述3个基因间的调控关系。结果表明,Myostatin通过下调MyoD的表达,抑制骨骼肌卫星细胞的分化,但这种抑制作用是受Smad3调节的。

猪植入前胚胎体外培养条件的优化

探讨了更换胚胎培养液及添加FBS、高渗透压和不同浓度VE对猪卵母细胞体外受精(IVF)和孤雌激活(PA)胚胎体外发育的影响,进一步优化了猪植入前胚胎体外培养体系。试验一:在第2天、第4天更换新的培养液(换液组),在换液基础上第4天更换为添加10%FBS的培养液(FBS组)。试验二:胚胎分别在0.05 mol/L蔗糖(蔗糖组)和138 mmol/L氯化钠(氯化钠组)的PZM-3(300~320 mOsmol)中培养2 d后移至PZM-3(288 mOsmol)中培养5 d。试验三:在培养液中分别添加50、100和200μmol/L VE。对照组均在PZM-3(288 mOsmol)中培养7 d。结果表明:试验一,IVF和PA胚胎FBS组囊胚率显著高于对照组和换液组(P<0.05);试验二,IVF胚胎氯化钠组卵裂率、囊胚率均显著高于对照组与蔗糖组(P<0.05);试验三,IVF胚胎添加100μmol/L VE组囊胚率显著高于对照组(P<0.05)。结果提示,在换液的基础上添加FBS有利于猪IVF和PA胚胎的体外发育;氯化钠调节的高渗透压可以促进猪IVF胚胎的早期发育;添加100μmol/L VE可以改善猪IVF胚胎的体外发育体系。

山羊耳皮肤成纤维细胞的传代培养及活力分析

目的 研究体外传代培养山羊耳皮肤成纤维细胞活力及染色体倍性。 方法 体外培养山羊耳皮肤成纤维细胞至 17代 ,并利用TUNEL原位分析、BrDU结合免疫标记以及低渗悬滴制备染色体的方法 ,对第 5代和第 17代细胞的细胞凋亡、DNA合成和染色体倍性进行了分析。 结果 山羊皮肤成纤维细胞在体外能够传代到17代以上 ,85 %以上 (42 4 9)的细胞染色体为正常的 2倍体 ,并且与第 5代的细胞相比较 ,细胞凋亡 (1 75 %vs1 15 % )、DNA合成 (17 4 3%vs 16 89% )都没有显著的变化 (P >0 0 5 )。 结论 长期传代培养 (17代 )的成纤维细胞的活力和DNA物质没有受到严重损伤 。

猪Krox20基因组织表达规律及其在脂肪细胞中表达规律的研究

采用半定量RT-PCR方法对1月龄和6月龄大白猪,1月龄野猪Krox20基因的表达规律进行研究,并且还检测猪脂肪细胞和不同月龄大白猪脂肪组织Krox20基因的表达情况。结果表明Krox20基因在大白猪和野猪的心、肝、脾、肺、肾、胃等12个组织中均有表达;各组织间表达存在差异,在心、肝、脂肪组织中高表达;1月龄大白和1月龄野猪Krox20的表达模式基本相同,不存在种属特异性;Krox20基因在不同时期的脂肪组织的表达随日龄的增加而降低,9月龄表达量最低;脂肪细胞水平的研究中,在前脂肪细胞中未检测到Krox20的表达,只有在诱导之后的5 h内,检测到Krox20的瞬时表达。

谷胱甘肽对哺乳动物卵母细胞的影响

谷胱甘肽与哺乳动物卵母细胞之间关系密切,谷胱甘肽具有一种还原能力。谷胱甘肽参与保护雌性配子细胞免受氧化物的伤害,还参与维持卵母细胞减数分裂纺锤体形态。卵母细胞中谷胱甘肽浓度可以作为衡量哺乳动物卵母细胞质和核成熟程度的标志。它对于受精后雄原核形成起了积极的作用,并且还有助于早期胚胎发育。卵丘细胞对卵母细胞内的谷胱甘肽合成起重要作用。不同种类的低分子量硫醇复合物可以诱导卵母细胞中谷胱甘肽的合成。

卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟及其后续发育的影响

观察了卵丘细胞共培养对小鼠生发泡期部分裸露(PNO)和裸卵(NO)成熟和发育能力的影响;分别用小鼠、大鼠、猪的卵丘细胞与小鼠PNO和NO进行了共培养。检测了小鼠PNO和NO的减数分裂能力、生发泡构型、受精和胚胎发育能力。结果,PNO、NO的减数分裂能力显著(P<0.05)低于卵丘完整复合体(COCs)的减数分裂能力。COCs中SN型卵母细胞比率显著高于PNO和NO中SN型卵母细胞比率(P<0.05),大部分PNO和NO的卵母细胞核型为NSN型。与对照组相比,与小鼠或大鼠卵丘细胞共培养的小鼠PNO和NO的减数分裂能力没有显著提高,但是与猪卵丘细胞共培养却可以提高小鼠PNO和NO的减数分裂能力。结果表明,猪卵丘细胞能促进小鼠卵母细胞的体外成熟,但并不影响小鼠卵母细胞的受精和胚胎发育。

卵丘在卵母细胞成熟中的作用

卵丘是指在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群;卵丘对于卵母细胞成熟有极其重要的作用。主要表现在卵丘参与维持卵母细胞减数分裂阻滞,诱导卵母细胞减数分裂恢复、支持卵母细胞细胞质的成熟。卵丘形态和卵丘扩展影响卵母细胞成熟。了解卵丘在卵母细胞成熟中的作用有助于帮助人们进一步揭示哺乳动物卵母细胞成熟的机制。