从SAGE文库筛选的家蚕正反交F_1代3个差异基因的组织表达分析

家蚕许多数量遗传性状在品种的正反交之间存在明显差异,研究产生性状差异的分子机制对于家蚕育种具有重要指导意义。基于家蚕品种75新与7532正反交F1代同性别间的SAGE文库,比较、筛选出与家蚕抗逆性相关的3个表达差异显著基因——线粒体硫氧还蛋白2(TRx2)基因、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)基因、抗菌肽(AMPs)基因。在幼虫5龄期设置高温(34℃)饲养环境,利用竞争性半定量RT-PCR方法检测3个差异基因在75新与7532的正反交F1代幼虫脂肪体、中肠和丝腺组织中的转录水平。TRx2基因和GPx基因在正反交F1代雌、雄幼虫的3个组织中均有表达,其中:TRx2基因在反交F1代雌、雄幼虫3个组织的转录水平总体上略高于正交F1代,表达趋势为先升高后降低,至5龄第6天的表达最高;GPx基因在正反交F1代雌性幼虫3个组织的转录水平在整个5龄期无明显差异,但雄性幼虫中该基因的转录水平在5龄第3天和第6天以反交F1代雄性幼虫略高,推测其抗氧化性能高于正交F1代雄性幼虫。AMPs基因在正反交F1代幼虫脂肪体中的转录水平最高,且正反交之间、雌雄之间无明显差异,推测该基因在脂肪体中的高水平表达对维持家蚕在高温环境下的体内稳态环境起重要作用。

应用基因表达系列分析(SAGE)技术研究高温处理前后家蚕的基因表达差异

高温对家蚕的生理和免疫能力有明显影响。为从分子水平上探究家蚕抗高温机制,应用基因表达系列分析(SAGE)技术获得家蚕5龄雌蚕高温处理前后中肠、丝腺和脂肪体组织的基因表达谱,构建高温组(34℃)和常温组(26℃)2个家蚕SAGE文库。2个家蚕SAGE文库分别包含3555107和3580976个原始标签,其中的标签种类分别为113684和131 296个,清洁标签的种类分别为45972和49467。比较2个文库清洁标签获得65 535种差异标签,共注释4249个基因,其中有1 062个差异表达的基因(P<0.05,错误检测率FDR≤0.001并且拷贝数的差异在2倍以上)。经GO分析发现2个文库中基因的分布极其相似,表明这些基因在不同的环境温度下有类似的生物学功能并参与类似的生理代谢过程。KEGG pathway分析显示有732个基因涉及176个KEGG路径,其中有40个为差异表达基因显著富集的路径(P<0.05),超过一半的路径与代谢、生物合成和信号传导有关。上述结果有助于对家蚕抗高温基因的鉴定以及探究基因调控的网络关系。

摄入异烟肼对家蚕幼虫体内谷胱甘肽氧化还原循环和谷胱甘肽S-转移酶活性的影响

为了建立家蚕Bombyx mori的药物筛选和毒性评价模型,以剂量为2 000 mg/kg的抗结核模药异烟肼饲喂家蚕5龄第3天幼虫后检测其中肠和脂肪体的抗氧化解毒相关代谢的变化。结果表明:雌蚕中肠组织中,总谷胱甘肽(GSH+2GSSG)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)含量均呈现迅速上升再缓慢下降趋势;谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性升高到较大值后逐渐降低;GSH/GSSG的比值下降表明,在72 min后中肠组织向氧化态转移。脂肪体组织中,总谷胱甘肽、GSH和GSSG含量变化均呈现迅速下降再迅速上升的趋势;GST活性达到最大值后逐渐降低后趋于平稳;GSH/GSSG比值升高表明,在72 min后脂肪体组织向还原态转移。无论雌蚕还是雄蚕,总谷胱甘肽、GSH和GSSG含量以及GST活性均是脂肪体高于中肠。雌蚕的总谷胱甘肽含量、GSH和GSSG含量高于雄蚕,但雄蚕的GST活性高于雌性。结果说明,摄入异烟肼引起了家蚕幼虫体内谷胱甘肽氧化还原状态的改变和酶活性的变化,在这个过程中脂肪体起主要解毒代谢作用。

对人工饲料摄食性不同的家蚕品种Cph2基因的表达特征分析

家蚕Bombyx mori不同品种对人工饲料的摄食性存在很大差异。为探讨食性差异的分子机理,本文基于对人工饲料摄食性不同的蚕品种(系)SAGE(serial analysis of gene expression)文库差异表达基因的分析,发掘了1条家蚕假定表皮蛋白(cuticular protein hypothetical)基因BmCph2。采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法,对BmCph2在不同摄食性蚕品种(系)不同发育时期的表达特征进行了研究。结果表明:BmCph2基因在家蚕幼虫眠期和起蚕期高表达,在胚胎期和幼虫将眠期几乎检测不到表达;在幼虫头部与全蚕的表达特征相似,而在中肠中表达活性很低,推测该基因表达可能与家蚕新表皮的形成有关。BmCph2在对人工饲料摄食性不同的蚕品种(系)中的表达存在较大差异,在摄食性好的高食性品种中表达量显著低于摄食性差的低食性品种;饲料和忌避剂的气味刺激及取食刺激对不同品种(系)该基因的表达有不同的影响,高食性蚕对诱导刺激比较敏感,而低食性蚕受影响较小,尤其是菁松A和菁松B的低食性品系几乎不受影响。本研究结果说明,BmCph2基因除可能参与表皮形成的同时,还与家蚕的食性有密切关系,但其具体机理有待于进一步研究。

家蚕正反交组合F_1代的基因表达系列分析(SAGE)文库构建

家蚕杂交组合存在普遍的正反交遗传表型差异现象,为探讨引起正反交组合遗传差异的分子机制,构建家蚕品种75新×7532正交F1代雌雄个体和7532×75新反交F1代雌雄个体共4个基因表达系列分析(SAGE)文库。通过正反交组合同性别子代样本间的比较,显示低表达的标签在种类上占大多数,而高表达的标签在数量上占绝对优势。以错误检测率(FDR)≤0.001且拷贝数倍数差异在2倍以上作为比较样本筛选差异表达基因(DEGs)的条件,在7532×75新的雄性样本里面有298个上调基因和46个下调基因,而在雌性样本里有453个上调基因和240个下调基因。进一步对差异表达基因进行GO和KEGG路径功能分析,筛选出在显著性富集路径中的差异表达基因,其中参与新陈代谢途径、氧化磷酸化途径以及信号传导途径的差异基因在反交组合的子代中表达明显上调。