精子与慢病毒孵育制备转基因猪的分子检测及遗传分析

【目的】在前期精子与慢病毒孵育法制备的转基因猪基础上,进一步探讨外源基因在转基因猪上的遗传状况.【方法】通过转基因猪与野生猪交配扩繁后,运用PCR和Southern-blot法对转基因G_1和G_2代进行外源基因的检测与遗传分析.【结果和结论】采用PCR法检测,G_1代PCR阳性率为25.42%(15/59);G_2代PCR阳性率为46.67%(7/15).在12头阳性转基因猪的13种组织中,外源基因在多种组织中均有存在;对阳性转基因猪的胃、垂体、下丘脑组织的RT-PCR检测结果显示,外源基因在66.67%(24/36)的组织样品中均有表达.表明在精子与慢病毒共孵育法制备的转基因猪中,外源基因能整合到猪的基因组,并遗传给后代.

小鼠腮腺组织特异性表达β-葡聚糖酶的研究

本研究旨在通过利用猪腮腺分泌蛋白启动子(PSP)在小鼠的腮腺组织中进行β-葡聚糖酶的表达。首先构建β-葡聚糖酶基因腮腺组织特异性表达载体,并通过原核注射法制备了转基因小鼠。PCR和Southern blot分析表明β-葡聚糖酶基因成功整合到小鼠的基因组中。RT-PCR和Northern blot显示β-葡聚糖酶基因在小鼠的腮腺中进行了特异性表达。

猪精子与慢病毒作用机制的探讨

在制备转基因动物的方法中,精子载体法(与质粒结合)因操作简单而备受关注,但整合效率低,遗传稳定性较差,而慢病毒载体具有良好的感染效率和整合效果,慢病毒与精子孵育制备转基因动物是转基因方法的有益尝试。本研究采用这一新方法成功制备出转基因猪。为了探索精子与慢病毒的相互作用机制,首先制备慢病毒,经梯度稀释法测定其滴度为1.2×105 ifu/mL。然后,用DNA酶消化去除慢病毒液中载体质粒,将慢病毒液与精子在17℃下共孵育2h后,再用RNA酶消化慢病毒颗粒,对精子进行RT-PCR、PCR和FISH检测。结果提示,慢病毒颗粒可能进入精子中。该发现为这一转基因新方法的建立提供了理论依据。

小鼠肠道中特异性表达β-葡聚糖酶的研究

本研究旨在活体水平上实现小鼠肠道组织中特异表达β-葡聚糖酶。采用人的粘蛋白启动子(MUC)构建β-葡聚糖酶基因肠道特异表达载体,并通过显微注射法制备了转基因小鼠模型。经PCR和Southern blot分析表明转基因小鼠获得成功。RT-PCR和Northern blot显示β-葡聚糖酶基因在小鼠的肠道中进行了特异性表达。酶活测定肠液中β-葡聚糖酶活性为12.3±0.12 IU/mL。

精子与慢病毒共孵育法制备转基因猪的检测

通过精子介导基因转移来制备转基因动物,因其操作简单而备受关注,但整合效率及稳定性差。慢病毒具有良好的感染及整合效率,精子与慢病毒相结合无疑是制备转基因动物新方法的有益尝试。本实验室采用第三代HIV-1慢病毒载体,以四质粒(pLV-siRNA1、pREV、pVsv-g、pGag-pol)共转染细胞293T获得慢病毒颗粒。