基于多重长PCR靶向捕获测序技术的高同源SNP鉴定

为建立一种高同源区段的单核苷酸多态性(SNP)基因分型技术,通过构建本地Blast对SNP所在的200和400 bp区段进行同源性评估,并筛选出高同源区段的SNP。利用第一轮多重长PCR(polymerase chain reaction)捕获329个样本的9个高同源区段SNP所在的长片段,使用纯化后的第一轮PCR产物作为模板进行扩增子建库测序,检测样本共得2 928个SNP位点信息,测序成功率高达98.885 6%。利用Hardy-Weinberg(HWE)法则计算试验研究的9个高同源区段SNP位点的基因频率(p值均大于0.05,符合HWE法则),并与NCBI(national center for biotechnology information)中千人基因组数据库中获取的基因频率相比对,发现二者单碱基基因频率一致(误差限<0.15)。研究表明,利用多重长PCR靶向捕获技术结合二代测序技术为高同源区段的SNP分型提供一个准确、快速、大样本检测方案。

中国菜粉蝶线粒体基因组遗传多样性分析

菜粉蝶Pieris rapae是十字花科蔬菜重要的农业害虫。为了深入了解中国菜粉蝶的群体遗传特征,通过高通量测序获取了中国5个群体48头菜粉蝶的线粒体全基因组,并分析了不同群体间的遗传结构与多样性。结果表明:菜粉蝶群体间有较高的线粒体单倍型多样性;相对封闭的山区和盆地地区的核苷酸多样性较低;群体间的平均遗传分化指数(F_(ST))仅0.042,表明不同群体间的遗传分化水平较低,这也暗示了群体间基因交流频繁,推测这与甘蓝等蔬菜频繁运输有关;线粒体进化树和网络图均未形成明显的地理谱系,南北方群体之间没有明显的遗传结构差异;总群体的Tajima's D和Fu's Fs值均为负值,且达到了显著水平,这意味着中国地区的菜粉蝶可能经历过群体扩张事件。

基于新型高保真Taq酶的多重等位基因特异性PCR方法的建立与应用

在8号染色体存在部分替换片段的小鼠上挑选3个SNP位点进行初步方案检验,包括高保真Taq酶的特异性测试以及引物浓度对分型结果的影响,并评价该方法的灵敏度;之后应用该技术检测野生1号染色体替换系小鼠上的9个SNP的不同样本。对Taq酶的特异性研究表明:引物在未引入突变的前提下检测结果与测序结果保持一致;引物稀释实验说明浓度最低为0.003~0.006μmol/L,灵敏度的检测结果表示最低浓度检测限可达0.07 ng/μL以下。最后检测得到5种标准样本的基因型,其代表9个SNP的组合。成功验证并建立该新型高特异性Taq酶应用于多重等位基因特异性PCR实验的总体流程。提供一套具备高特异性、能够针对多个SNP位点进行检测的低成本方案,对多重等位基因特异性PCR技术的开发同样具有参考价值。

抗菌肽Adenoregulin基因工程菌培养条件的优化及分批发酵研究

Adenoregulin(ADR)是来源于南美树蛙Phyllomedusabicolor皮肤的含有33个氨基酸的抗菌肽,在非极性环境中形成α_螺旋型结构,具有抗菌活性强、抗菌谱广的特点。将ADR基因克隆于pET32a载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),对这一工程菌株的培养条件进行了优化。通过正交试验,考察诱导时机、诱导剂量和诱导时间三个因素的不同水平对蛋白表达的影响,结果发现诱导时机的影响尤为显著,考察了9种不同培养基对表达量的影响,发现培养基中加入葡萄糖对目标蛋白的稳定表达起了重要的作用,确定最佳培养条件为:培养基为2×YT+0·5%葡萄糖,诱导时机为OD600=0·9左右,诱导剂IPTG加入的终浓度为0·1mmol/L,诱导时间为4h。采用前期恒pH、后期指数流加的策略进行工程菌BL21(DE3)/pET32a_adr的高密度培养,在整个流加过程中,通过控制葡萄糖的加入量,将菌株的比生长速率控制在0·15h-1,乙酸浓度也被控制在较低的水平(<2g/L),但是质粒丢失严重,在发酵结束时,约有40%的大肠杆菌中不带质粒,这导致了目标蛋白的表达量下降严重,但是表达的目标蛋白90%以上为可溶性形式。表达的融合蛋白无抑菌活性,而裂解后得到的ADR单体具有明显的抑菌活性。

融合蛋白表达载体pGEX及其应用

表达融合蛋白的载体pGEX是Smith和Johnson于1987年构建的［1］；它的特点是在载体上接上了一种26kD的谷胱甘肽S-转移酶基因，与其它的融合载体相比，它具有纯化条件温和、步骤简单、无变性剂加入，以及纯化后蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性的特点；具有较好的应用价值。

普通遗传学实验教学的改革与探索

在基因组时代,生物专业"普通遗传学"课程的教学内容中已经越来越多地增加了分子遗传及基因组学研究的内容。为配合理论教学,对普通遗传学实验内容进行了较大的调整,以期增加学生的学习兴趣,提高学生的实验技能,培养学生的创新能力。

人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的融合表达

将人碱性成纤维细胞生长因子ｈｂＦＧＦ基因克隆于质粒ｐＧＥＸ，构建了融合蛋白ＧＳＴ－ＦＧＦ的表达质粒ｐＧＥＸ－ＦＧＦ，将ｐＧＥＸ－ＦＧＦ转化大肠杆菌ＤＨ５α，诱导培养后测得融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的２２％，每升发酵液中可产生１８８ｍｇＧＳＴ－ＦＧＦ。纯化后的ＧＳＴ－ＦＧＦ用ＥＬＩＳＡ方法检测，证明它有ＦＧＦ的抗原性，以鼠ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３测得它具有ｂＦＧＦ的促细胞分裂活性。

“高级细胞生物学”硕士研究生课程教学改革探索

"高级细胞生物学"是为生物化学与分子生物学专业硕士研究生开设的一门专业必修课,重点讲授动物细胞的运动、代谢、物质传递和信息交流的分子机制及其化学本质,穿插以分子细胞生物学的最新研究成果及研究技术,并对课程进行了国际化探索,旨在培养学生的国际视野,从知识储备和思维方式等方面为从事科研工作做准备。

乙酸对重组大肠杆菌生长及外源基因表达的影响

在重组基因工程菌ＤＨ５α（ＰＧ－ＦＧＦ）的高密度培养过程中，发现培养液中有大量代谢副产物－乙酸的产生和积累，乙酸的存在抑制了工程菌的生长及外源基因的表达。研究了乙酸在Ｍｇ培养基中对工程菌ＤＨ５α（ＰＧ－ＦＧＦ）生长及外源基因表达的影响。结果表明，乙酸的存在不仅导致重组菌生长速率的降低及延迟期的增长，而且对外源基因产物的表达具有强烈的抑制作用，这为该工程菌的高密度培养及外源基因产物的高表达打下了基础。

基于PCR-LDR平台的近交系小鼠遗传质量快速检测方法

目的建立基于PCR-LDR平台的近交系小鼠SNP快速分型方法,用于检测实验小鼠的遗传质量与品系纯度。方法利用可移植性极高的PCR-LDR技术,以常见近交系小鼠为研究对象,选取了21条染色体上的45个SNP位点,分别设计引物和探针,经过筛选和验证,建立了多重PCR-LDR(polymerase chain reaction and ligase detection reaction,PCR-LDR)分型方案。结果四组多重PCR-LDR可实现45个SNP位点的基因分型,其中43个、44个与45个SNP在样本中的检出率分别为100%、90.9%与36.4%。所有样本经分型确定为纯合体,并得到了常见近交系小鼠SNP位点信息。结论实现了常见近交系小鼠快速、高通量的基因分型,可用于遗传质量检测和品系鉴定。

新型通用探针LDR分型技术的开发及细胞色素P450基因多位点分型

构建了一种可同时对多个位点进行基因分型的新型通用探针连接酶检测方案．与普通的连接酶检测方案相似．具有灵敏度高和特异性强的特点．但降低了50％～90％的探针设计与合成成本。利用该方案对115例正常中国人的细胞色素P450系统的6个位点进行基因分型．样本测序与基因频率的统计学分析验证了该方案准确可靠。

用于“野生小家鼠来源一号染色体替换系”构建的PCR-LDR分型系统

目的建立用于"野生小家鼠来源一号染色体替换系"构建的PCR-LDR(polymerase chain reactionand ligase detection reaction,PCR-LDR)分型系统。方法采用易于判断的二元性遗传标记单核苷酸多态性位点(single nuclear polymorphism point,SNP),应用连接酶检测技术(ligase detection reaction,LDR),建立PCR-LDR分型方案。结果三组多重PCR-LDR分型方案适用于覆盖整条一号染色体的29个SNP遗传位标的分型,位点间平均遗传距离在6.25厘摩(centimorgan,cM)。结论实现了后代小鼠快速、高通量的基因分型,可准确检测1号染色体各区段的重组事件。

人碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的表达

用 Nco 和 Bam H 酶切 ,获得人碱性成纤维细胞生长因子 (hb FGF)基因 ,将该基因插入原核高效表达载体 p BV2 2 0的 PLPR启动子下游 ,获得重组质粒 p BV- FGF,转化大肠杆菌DH5α,42℃诱导使重组子表达。SDS- PAGE、Western- blot、MTT活性检测结果表明 ,该重组菌能够表达具有生物活性的 hb

哺乳期营养状况对小鼠性发育启动时间的影响

选用近交系BALB/c小鼠,按每只母鼠哺乳出生后小鼠数量的多少分成营养过剩、营养均衡和营养不良3组,研究哺乳期营养状况对小鼠性发育启动时间的影响,以阴门开启和阴茎包皮分离分别作为雌鼠和雄鼠性发育启动的指标。雌小鼠性发育启动年龄:营养过剩组<营养均衡组<营养不良组(P<0.002),但是,3组小鼠性发育启动时的体重没有明显差异。雄小鼠性发育年龄:营养过剩组<营养均衡组<营养不良组(P<0.01);而发育时体重:营养过剩组>营养均衡组>营养不良组(P<0.01)。哺乳期营养状况对小鼠性发育启动时间有重要影响,但影响方式存在性别差异。

小鼠白内障基因突变方式、分布及基因定位

哺乳动物发育相关的功能基因的鉴定多来源于自发或诱发突变的小鼠。小鼠白内障作为较易鉴定的性状,目前业已明确的突变多达140余个。自发突变的小鼠主要来源于大规模饲养,诱发突变主要通过X射线与ENU处理获得,基因敲除与转基因小鼠亦可获得白内障性状。已知的白内障相关基因分布于小鼠20条染色体,其中以1号染色体最多,并常于小鼠胚胎时期起始表达。小鼠白内障表型多由单基因突变引起,突变的确定主要通过F2代家系全基因组扫描、精细定位、单倍型分型与测序验证等程序。本文从小鼠白内障基因突变来源、基因分布、基因定位与基因表达等角度较为全面的阐述了小鼠先天性白内障的研究进展。

分离培养适用于染色体分选的新生小鼠皮肤成纤维细胞

采用酶消化法分离培养新生小鼠皮肤成纤维细胞(mouse skin fibroblasts,MSFs).通过噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术(flow cytometry,FCM),深入探讨不同培养基和血清浓度对MSFs增殖率和同步化效率的影响.结果表明:酶消化法能快速获取大量健康、高活力的MSFs;在杜氏培养液(DMEM)传代培养条件下,P2代MSFs具有高增殖率和有丝分裂指数;地美可辛工作浓度为0.05μg/mL时,阻断同步化获取M期MSFs的效率最佳.研究结果为流式细胞术分选染色体提供实验材料和研究基础.

谷胱甘肽合成酶系基因协调表达体系的构建

通过 PCR获得 E.coli B谷胱甘肽合成酶系基因 ( gsh I,gsh II)片段 ,结合定点突变稀有起始密码子 ,设定 gsh I与 gsh II位置与距离 ,构建双顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I- gsh II,建立GSHI、GSH- II蛋白表达体系。结果表明 :以 0 .0 8mmol/L IPTG于 2 8℃诱导工程菌 E.coli BL2 1( DE3) ( p Trc99A/gsh I- gsh II) ,GSH- I、GSH- II蛋白比为 4.5∶ 1 ( m∶ m)时谷胱甘肽合成能力最高 ,达到每克湿菌体 8.5 mg。通过构建单顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I、p Trc99A/gsh II测定GSH- I与 GSH- II蛋白的最适配比 ,结果表明 :在 GSH- I、GSH- II蛋白总量恒定的情况下 ,要提高谷胱甘肽产率 ,两者比例以 3∶ 1～ 6∶

东方田鼠指名亚种的线粒体基因组序列分析及系统进化研究

目的获得东方田鼠指名亚种的线粒体基因组序列，为东方田鼠的遗传结构和系统进化研究提供分子数据。方法照近缘的台湾田鼠的线粒体基因组序列（Microtuskikuchii，NC003041．I）设计9对引物，利用传统和长距离PCR结合引物步移的策略，首次完成了东方田鼠指名亚种的线粒体基因组测序（Genbank：JF261174），并对该物种的线粒体基因组序列进行了分析，并利用线粒体基因组上的细胞色素易（Cyt易）基因序列构建系统进化树，探讨中国东方田鼠的系统进化关系。结果东方田鼠指名亚种的线粒体基因组全长16312bp，含有13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和一个非编码控制区。同时，在其控制区，分别发现了终止序列区（EATS1、EATS2）、中央保守区I（CSB1）的相关保守序列和一个保守的Poly（C）10区段。在比较了东方田鼠指名亚种和长江亚种以及近缘物种的线粒体轻链复制起点（O_L）序列的二级结果，发现茎环结构在茎和邻近序列处表现出高度保守性，而在环上的序列却存在着一定差异。通过Cytb基因构建的系统进化树表明中国的东方田鼠与分布于俄罗斯的Microtusmiddendoffi田鼠，表现出最亲缘的系统进化关系。结论中国东方田鼠指名亚种线粒体基因组各编码基因的长度、位置符合典型的脊椎动物特征，本研究的结果将为中国东方田鼠的系统进化、亚种分类研究提供重要的数据参考。

B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增获得了编码BLys(134-285AA)的cDNA片段,该片段以限制性内切酶Bgl 和Hind 双酶切插入pET32a载体。测序表明除(ATA263→ATG263)突变并导致了氨基酸(I263M)突变外,其余序列与Genbank报道的序列一致。蛋白表达用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE表明:在33ku处有明显的融合蛋白表达,其表达水平高达总菌体蛋白的50%。点印迹证实融合蛋白能与anti-His6Tag抗体反应。生物学活性研究表明BLys协同丝裂霉素能明显地抑制HeLa细胞的生长。

分泌型TAT蛋白转导结构域基因通用真核表达载体的构建及表达

目的:构建一个全新的分泌型TAT蛋白转导结构域基因哺乳动物细胞融合表达载体并对融合蛋白的表达进行分析。方法:依照编码TATPTD11肽及所引入的BamHI酶识别序列和增强性绿色荧光蛋白N端7个氨基酸的碱基序列合成了3条引物,以egfp基因为模板通过依次3轮PCR扩增得到tategfp融合基因,该基因片段以SfiI和HindⅢ双酶切后插入哺乳动物细胞表达载体pSectagA,构建成重组载体pSecTATmegfp,BamHI单酶切后该载体自连,即得到可通用的真核表达载体pSecTATm,重组质粒pSecTATmegfp转染HEK293细胞,融合蛋白的表达用Westernblot分析。结果:酶切及测序证实表达载体pSecTATm构建成功,Westernblot表明TATEGFP融合蛋白在HEK293细胞中获得表达并分泌到细胞培养液中。结论:成功地构建了分泌型TAT蛋白转导结构域基因的哺乳动物细胞融合表达载体,为更充分发挥TAT蛋白转导结构域在蛋白质功能及疾病治疗研究中的应用打下了基础。