数字PCR技术及其在临床检验中的研究进展

数字聚合酶链反应(dPCR)技术是一种新的分子诊断技术,相比实时荧光定量PCR(qPCR),它有着更高的精度、灵敏度和特异度。dPCR目前在生物医学领域已经获得了广泛的应用,如病原体与拷贝数变异检测、miRNA与单细胞基因表达分析、下一代测序和染色体异常检测等。该文立足于临床检验应用,概述了dPCR技术的原理与分类,并将其与qPCR和下一代高通量测序(NGS)技术进行了比较分析,介绍了dPCR在临床检测中的技术发展及最新成果,探讨了其在临床实际应用中面临的挑战和发展前景。

多重数字PCR平台检测cfDNA突变在NSCLC患者中的应用评估

目的基于多重数字PCR(dPCR)技术检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆游离DNA(cfDNA)中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变,评估其检测性能及临床应用价值。方法选取不同浓度EGFR-19Del、L858R、T790M突变的质粒样本作为研究对象,对基于多重dPCR的新平台进行性能验证(包括检测精密度、灵敏度、空白限与线性范围)。收集2019年6月至2020年11月复旦大学附属中山医院呼吸科确诊的49例NSCLC患者标本,采用多重dPCR和Super-ARMS方法分别检测cfDNA标本中EGFR基因突变水平,使用卡方检验比较两组间的差异,并进一步比较检测结果的一致性。结果多重dPCR平台检测L858R、19Del、T790M 3种常见突变,在10%、5%、1%的检测精密度均达到厂商声明的CV<15%;对于3种常见突变位点在不同检测限(0.5%、0.1%、0.05%)的检测均报告阳性。L858R、19Del、T790M突变的检测空白限分别为0.0382、0.000和0.053。T790M、19Del、L858R突变百分比在0.05%~10%(0.05%、0.1%、0.5%、1%、10%)时,实测值与预期百分比的线性回归方程中的R 2值分别为0.9977,0.9954和0.9984,P<0.01,相关性显著。49例临床样本中,基于多重dPCR与Super-ARMS技术检测S768I、G719X、19Del、T790M、20ins、L858R突变的方法总符合率分别为100%、100%、100%、97.96%、93.62%和89.80%。两方法检测L858R(χ^(2)=0.425,P>0.05)、T790M(χ^(2)=0.089,P>0.05)、19Del(χ^(2)=0,P>0.05)、20ins(χ^(2)=0.211,P>0.05)结果差异均无统计学意义。结论多重dPCR新平台检测cfDNA EGFR基因常见突变的性能较好,在评估突变丰度中具有优势,可为肿瘤精准治疗提供实验依据。