幽门螺杆菌东亚型菌株GZ7/cagA^(+)和GZ7/ΔcagA源外膜囊泡的蛋白组学比较

目的通过分离、鉴定和比较细胞毒素相关基因A蛋白(cagA)、阳性幽门螺杆菌(H.pylori)、东亚型菌株GZ7/cagA^(+)及其cagA敲除菌株GZ7/ΔcagA来源的外膜囊泡(OMVs)中的差异表达蛋白(DEPs),分析cagA基因对OMVs中蛋白表达的影响。方法采用超速离心法分别提取GZ7/ΔcagA和GZ7/cagA^(+)的OMVs,通过透射电镜和纳米颗粒追踪技术鉴定其形态和粒径,使用Western blot技术验证两组OMVs中cagA蛋白的表达,分析OMVs的蛋白质组学;对蛋白组学数据进行质控分析和主成分分析鉴定后,以上调蛋白倍数变化(FC)>2.0、下调蛋白FC<0.5,FDR≤0.05为筛选条件筛选DEPs,利用OmicsBean在线工具、Gene Ontology和KOBAS对DEPs进行生物信息学分析;采用免疫荧光鉴定OMVs细胞在细胞中的定位,实时无标记细胞分析仪检测细胞活性。结果通过电镜和粒径证实成功分离纯化了OMVs;蛋白质组分析发现,GZ7/cagA^(+)-OMVs组与GZ7/ΔcagA-OMVs组比较有79个DEPs,其中38个蛋白下调、41个蛋白上调;生物信息学分析显示,DEPs主要与丙酮酸代谢、丙酸代谢、糖酵解/糖异生及柠檬酸循环等代谢途径有关;免疫荧光和实时无标记细胞分析证实H.pylori来源的OMVs能进入细胞并定位在线粒体并抑制细胞增殖。结论cagA能影响H.pylori分泌的OMVs中蛋白质的成分,DEPs可能促进cagA^(+)H.pylori在胃黏膜上的定植及致病性。

沉默神经元特异性烯醇酶基因对肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究神经元特异性烯醇酶(NSE)对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法用免疫细胞化学检测人小细胞肺癌(SCLC)细胞株NCI-H446和非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549中NSE蛋白的表达,再用RNA干扰技术抑制细胞中NSE基因的表达,最后用流式细胞术、Western blotting及分光光度法检测NSE基因下调后细胞周期分布、Ki67蛋白表达、凋亡细胞百分率及Caspase-3活性。结果 A549和NCI-H446细胞均表达NSE蛋白,特异性siRNA转染显著抑制了细胞中NSE基因的表达,抑制率达90%以上,NSE下调后细胞中S期细胞百分率、Ki67蛋白表达量显著降低,而凋亡细胞百分率和Caspase-3活性显著增加。结论 NSE基因的表达促进了伴有NE分化的肺癌细胞的增殖和抑制细胞凋亡,这可能是NE分化的肺癌细胞具有更为恶性表型的原因之一。

人类胃组织复合表达两种不同剪接的胆囊收缩素-B/胃泌素受体

为了探讨正常和异位剪接的胆囊收缩素 - B/胃泌素受体基因是否在人类胃上皮细胞中表达及其表达量与胃癌分化和转移的关系。检测了 30例胃癌和癌周正常胃组织上皮细胞、10例胃炎和 2例胃正常组织上皮细胞及胃癌细胞株 SGC- 790 1中这两种受体基因的表达水平。结果显示 ,正常、炎症和恶性胃上皮细胞同时表达正常和异位剪接的胆囊收缩素 - B/胃泌素受体 ,两种受体的表达量与胃癌的分化与转移无关。推测异位剪接的胆囊收缩素

幽门螺杆菌对胃癌细胞中钙调蛋白基因启动子区去甲基化的诱导作用

目的:探讨钙调蛋白(CaM)基因在胃癌组织中的表达及其启动子区甲基化水平与幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染的关系.方法:用实时荧光定量PCR法分别检测30例胃癌组织、癌周组织及转移淋巴结组织中CaM基因的表达量,并分析其表达量与H.pylori感染的关系.体外建立H.pylori感染胃癌细胞的实验模型和H.pylori细胞毒素相关蛋白A(cagA)基因稳定转染胃癌细胞的实验模型,以未处理的胃癌细胞为对照,用亚硫酸氢盐修饰后测序法检测实验模型细胞中CaM基因启动子区甲基化水平.结果:胃癌组织中CaM基因的表达量是癌周组织的2.08倍(P<0.05);H.pylori感染组中CaM基因的表达量是无H.pylori感染组的6.11倍(P<0.01),H.pylori及其毒素蛋白CagA可引起CaM基因启动子区-276位点发生去甲基化修饰.结论:H.pylori感染通过所分泌的毒力因子CagA诱导胃癌细胞中CaM基因启动子区去甲基化修饰,从而上调胃癌组织中CaM基因的表达.

线粒体凋亡途径的研究进展

线粒体凋亡途径是细胞凋亡的主要途径之一,是目前研究凋亡的热点。各种凋亡刺激信号通过BH3(Bcl-2 homology domain 3)-only蛋白引起Bax(Bcl-2-asslciated protein X)蛋白移位到线粒体外膜并多聚化,形成膜通道,刺激线粒体释放细胞色素C(Cyt C)和Smac(second mitochondrial-derivedactivator of caspase),Cyt C通过Apaf-1因子的多聚化与胱天蛋白酶(caspases)-9形成凋亡小体,导致下游胱天蛋白酶的级联反应。而凋亡蛋白抑制因子(IAP)和Smac通过抑制和促进胱天蛋白酶的级联反应来调控细胞凋亡。

胆囊收缩素受体、配体与肿瘤的研究

胆囊收缩素 (CCK)、胃泌素及甘氨酸延伸型胃泌素作为生长因子通过不同的CCK受体亚型发挥不同的生物作用。CCK受体的新亚型CCKC受体、甘氨酸延伸型胃泌素受体及CCK2受体的剪接变异体相继在人类多种肿瘤细胞中发现 ,受体的表达在肿瘤细胞的生长、侵袭和转移中发挥重要功能 。

沉默胃泌素基因抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

胃癌细胞分泌的胃泌素与胃癌的发生、发展密切相关.为了探讨胃泌素对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,本文构建靶向胃泌素基因的siRNA表达载体,转染胃癌细胞AGS,成功获得沉默胃泌素基因的稳转胃癌细胞株AGS/Gas-siRNA.用MTT实验、软琼脂集落形成实验、细胞伤愈实验、Transwell实验及ELISA检测沉默胃泌素基因后细胞的增殖、迁移、侵袭及转移相关蛋白基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量.结果显示:与空载体转染的对照细胞比较,沉默胃泌素基因的细胞,其增殖率和克隆形成率显著降低,迁移和侵袭到Transwell下室的细胞数分别降低了31.6%和34%.培养上清液中MMP-2和VEGF含量也低于对照细胞.结果提示,沉默胃泌素基因的胃癌细胞,通过降低MMP-2和VEGF分泌,抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭,这可能是胃泌素促进胃癌侵袭转移的机制之一.

过表达胃泌素促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

胃癌患者转移淋巴结中胃泌素基因的表达量是原发胃癌组织的42倍,推测胃泌素可能与胃癌转移密切相关.本文通过构建含胃泌素基因的真核表达载体,成功获得过表达胃泌素的稳转胃癌细胞株AGS和SGC-7901,并用MTT、细胞伤愈实验、Transwell小室实验及ELISA检测过表达胃泌素对细胞迁移、侵袭及转移相关蛋白基质金属蛋白酶2(MMP-2)分泌能力的影响.结果显示,过表达胃泌素稳转细胞的相对增殖率、迁移入细胞致伤区的相对距离比对照组高,迁移和侵袭到Transwell下室面的细胞,以及培养液中每mg蛋白质的MMP-2浓度也高于对照组的细胞.结果提示,胃泌素通过促进胃癌细胞分泌MMP-2来增强细胞的迁移和侵袭能力.该研究对揭示胃癌转移的分子机制具有重要意义.

胃泌素促进胃癌细胞的迁移和侵袭

目的:研究胃泌素在胃癌细胞迁移和侵袭中的作用。方法:用细胞划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验检测10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素处理后胃癌细胞AGS和SGC-7901迁移和侵袭能力的变化,MTT法检测细胞增殖能力,ELISA法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的含量。结果:10 nmol/L和100nmol/L胃泌素处理胃癌细胞后,细胞迁移和侵袭能力增强。对照组、10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素组AGS细胞平均迁移数分别为56.0、88.1和106.4/view,SGC-7901细胞平均迁移数分别为52.8、91.0和113.3/view,AGS细胞平均侵袭数分别为78.4、118.7和141.6/view,SGC-7901细胞平均侵袭数分别为87.3、124.6和147.4/view(均P<0.01);100 nmol/L胃泌素组细胞迁移和侵袭能力均高于10 nmol/L组(P<0.05);胃泌素处理后细胞的增殖率及MMP-2的分泌量也显著增加(P<0.05)。结论:胃泌素通过促进MMP-2的分泌以剂量依赖的方式增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力,可能是体内胃癌细胞增殖、侵袭和转移的重要机制之一。

钙调蛋白、钙网蛋白及周期蛋白依赖性激酶1基因在胃癌组织中的表达

目的研究钙调蛋白(CaM)、钙网蛋白(CRT)及周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)基因在胃癌组织中的表达,及其与胃癌发生发展的相关性。方法实时定量PCR法定量检测CaM、CRT及CDK1基因在人胃癌组织中的表达,并分析其表达与临床病理参数、幽门螺杆菌感染的关系。结果胃癌组织和淋巴结组织中CaM、CRT及CDK1基因的表达比癌旁组织高2.08～3.70倍,幽门螺杆菌感染组中此三个基因的表达比非感染组分别上调2.78～7.36倍。其中CaM基因的表达与生存时间相关,CDK1基因的表达与pTNM分期及淋巴结转移相关,而CRT基因的表达与肿瘤大小、生存时间及淋巴结转移相关。结论 Hp通过上调CaM、CRT及CDK1基因的表达参与胃癌的发生发展,联合检测三个基因对判断预后有一定作用。

胃泌素对胃癌细胞EMT和Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响

目的探讨高表达胃泌素(gastrin)对胃癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响及可能机制。方法用gastrin过表达质粒pcDNA3-gastrin及空载体pcDNA3.1转染胃癌细胞SGC-7901、MKN45,48 h后收集细胞蛋白,Western印迹检测鉴定gastrin表达,检测EMT相关标志物E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、Snail及wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路相关基因wnt3α、β-catenin、c-myc的蛋白表达变化。结果在SGC-7901、MKN45细胞中成功过表达gastrin。与pcDNA3.1空载体转染组相比,pcDNA3.1-gastrin转染SGC-7901、MKN45细胞中上皮标志蛋白E-cadherin表达下调,间质标志蛋白N-cadherin、Snail表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);同时Wnt/β-catenin通路蛋白相关蛋白wnt3α、β-catenin及其下游基因c-myc的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达gastrin能够激活Wnt/β-catenin信号通路和促进胃癌细胞SGC-7901和MKN45发生EMT。

JAK2、ERK1干扰对幽门螺杆菌毒素相关蛋白CagA调控胃泌素基因表达的影响

目的:探讨JAK/STAT3和MAPK/ERK两条信号转导通路在分析和推断CagA调控胃泌素基因表达机制中的作用.方法:将含cagA基因的表达质粒和幽门螺杆菌(CagA阳性)株分别转染和感染胃癌细胞AGS和SGC-7901,同时用siRNA阻断jak2及erk1基因的表达,48h后通过RT-PCR、Western blot检测细胞中有无CagA蛋白表达,实时荧光定量PCR检测胃泌素的变化.结果:转染组和感染组中均检测到CagA蛋白的表达,与对照相比胃泌素mRNA在转染组分别增加了26.58倍(AGS细胞)和5.59倍(SGC-7901),在感染组分别增加1.88倍(AGS细胞)和8.59倍(SGC-7901),表达量显著增高;siRNA干扰JAK2和ERK1后胃泌素mRNA表达量降低,在转染组JAK2干扰抑制率分别为81.50%(AGS)和99.00%(SGC-7901),ERK1干扰抑制率分别75.55%(AGS)和97.00%(SCG-7901).在感染组JAK2干扰抑制率分别为55.30%(AGS)和90.00%(SGC-7901),ERK1干扰抑制率分别38.30%(AGS)和92.00%(SGC-7901).结果显示ERK/MAPK和JAK/STAT通路阻断,抑制了CagA调控的胃泌素mRNA表达.结论:CagA上调胃泌素基因的表达,siRNA干扰阻断JAK/STAT和ERK/MAPK这两个信号通路,可以抑制CagA对胃泌素mRNA表达的调控.

胃泌素/CCK-B受体环对多种肿瘤细胞生长和凋亡的影响

目的探讨胃泌素/CCK-B受体环对肝癌、肺癌和乳腺癌细胞生长和凋亡的影响。方法用免疫细胞化学检测肺癌A549细胞、肝癌Hep G2细胞及乳腺癌MCF-7细胞系中胃泌素和CCK-B受体的表达。再用CCK-B受体拮抗剂丙谷胺(5 mmol/L)处理细胞(实验组),分别用MTT实验、流式细胞仪及分光光度法检测3种癌细胞的生长曲线、细胞凋亡及caspase-3的酶活性,对照组未用丙谷胺处理。结果肝癌Hep G2细胞、肺癌A549细胞和乳腺癌MCF-7细胞中胃泌素和CCK-B受体的表达均为阳性;与对照组比较,实验组细胞的生长被显著抑制,caspase-3酶活性和凋亡细胞百分数显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论胃泌素/CCK-B受体环参与肝癌、肺癌和乳腺癌细胞的生长和凋亡,阻断此环能抑制细胞的生长,促进细胞凋亡。

抗坏血酸对大鼠成骨细胞膜片BMP-2mRNA表达的影响

目的研究抗坏血酸对成骨细胞膜片BMP-2mRNA表达的影响.方法：原代培养并鉴定大鼠成骨细胞,采用物理刮取法,体外构建成骨细胞膜片;成骨细胞接种后,分别加入15、50、85mg/L抗坏血酸,连续培养1～2周,RT-qPCR检测成骨细胞膜片BMP-2mRNA的表达.结果：获得的细胞符合成骨细胞形态学特征特性.可构建管状形态的成骨细胞膜片.组间比较,第1周和第2周成骨细胞膜片中BMP-2mRNA表达量实验组均高于对照组,以50mg/L组的表达量最高（第1周P〈0.05;第2周P〉0.05）;组内比较,各组表达量第2周均高于第1周（P〈0.05）.结论：抗坏血酸可促进成骨细胞膜片BMP-2mRNA表达.

transgelin基因在幽门螺杆菌感染胃癌细胞及人胃癌组织中的表达

目的研究幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,HP）感染胃癌细胞及人胃癌、淋巴结组织中转凝蛋白基因（transgelin）的表达水平,探讨HP感染、transgelin基因与胃癌发生、发展的相关机制。方法用HP感染胃癌细胞系AGS和SGC-7901,同时收集胃癌患者手术切除的胃癌组织、切缘组织和淋巴结组织,提取及纯化总RNA。实时荧光定量PCR检测transgelin mRNA的表达水平,分析其与临床病理参数的关系。结果 transgelin mRNA在HP感染的AGS、SGC-7901细胞中的表达量增加,分别为对照细胞的11.39倍（t=30.025,P=0.000）、3.41倍（t=5.677,P=0.005）;transgelin mRNA在胃癌组织、淋巴结组织中的表达增加,分别是切缘组织的6.48倍（t=2.290,P=0.026）、2.64倍（t=2.043,P=0.046）;Ⅳ期胃癌组织transgelin mRNA表达量增加,是Ⅰ~Ⅱ期的2.32倍（t=2.111,P=0.049）;淋巴结转移组是无淋巴结转移组的2.93倍（t=2.123,P=0.043）。结论HP可上调transgelin基因的表达,transgelin基因可能参与胃癌的发生、发展,且与p TNM分期及淋巴结转移相关。

氯离子通道蛋白及β-肌动蛋白基因在人胃癌组织中的表达

目的:研究Hp(Helicobacter pylori,Hp)感染在胃癌发生发展中的作用。方法:运用实时定量PCR法检测氯离子通道蛋白基因(Chloride ion channel protein,CICP)及β-肌动蛋白基因在50例人胃癌组织的表达,并分析其表达与临床病理特征和胃癌组织中Hp感染状态的关系。结果:两个基因在人胃癌组织及淋巴结组织的表达显著高于癌旁组织(P<0.05)。氯离子通道蛋白基因的表达与胃癌患者pTNM分期及患者生存期相关(P<0.05),而β-肌动蛋白基因的表达与pTNM分期及淋巴结转移相关(P<0.05);人胃癌组织中Hp的感染与氯离子通道蛋白及β-肌动蛋白基因的表达上调相关(P<0.05)。结论:Hp的感染可以上调胃癌组织中氯离子通道蛋白及β-肌动蛋白基因的表达,检测这两个基因的表达对预测胃癌患者的预后有一定作用。

胃泌素/胆囊收缩素受体环对胃癌细胞增殖迁移的影响

目的探索胃泌素/胆囊收缩素受体环对胃癌细胞增殖迁移的影响。方法用免疫细胞化学方法检测人胃癌细胞SGC-7901、AGS和胃黏膜上皮细胞GES-1细胞中胆囊收缩素-B(CCKB)受体的表达。分别培养这3种细胞,用不同终浓度胃泌素(10、100 nmol/L)处理细胞,以未加胃泌素的细胞为对照,用细胞划痕实验和四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞的增殖迁移能力。结果胃癌细胞SGC-7901、AGS中CCKB受体表达强阳性,而GES-1细胞中CCKB受体表达弱阳性;不同浓度胃泌素处理细胞后,SGC-7901、AGS细胞的增殖迁移能力明显增强,而GES-1细胞无明显改变;对照组、10 nmol/L胃泌素处理组及100 nmol/L胃泌素处理组中SGC-7901细胞的相对增殖率分别为100%、191.13%、212.65%,AGS细胞的相对增殖率分别为100%、189.27%、209.19%,各组间差异均有统计学意义(P均<0.01);而GES-1细胞的相对增殖率分别为100%、113.01%、116.12%,各组间差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 CCKB受体表达水平的高低对胃泌素/CCKB受体环促进胃癌细胞的增殖和迁移起重要作用。

一种简便的幽门螺杆菌液体培养法的构建

目的:建立一种简便、有效的幽门螺杆菌(H.pylori)的液体培养法。方法:取脑心浸液9 m L、胎牛血清1 m L、H.pylori选择剂(万古霉素、头孢磺啶、甲氧氨苄嘧啶及两性霉素B)400μL制成H.pylori液体培养基,将H.pylori接种于H.pylori液体培养基,在厌氧罐中通过微需氧袋建立微需氧条件,于37℃振荡培养3 d,同时设立传统固体培养基培养的H.pylori作为对照;观察2种方法培养的H.pylori生长状况及H.pylori形态,比较2种方法培养的H.pylori的尿素酶、氧化酶及触酶试验结果。结果:固体培养到第3天时,H.pylori生长良好,哥伦比亚血琼脂平板上见透明、针尖样菌落形态;液体培养第3天时可见培养基明显浑浊,涂抹少量菌液于无抗生素的哥伦比亚血琼脂平板培养,肉眼未见污染菌生长,并有透明、针尖样的菌落长出;革兰染色后,固体培养基中的H.pylori为螺旋状、海鸥状、S状弯曲菌或短杆菌;液体培养基中的H.pylori则多为螺旋短杆状、亦见部分长丝状细菌,有的互相缠绕聚集成团,有的散在分布;取两种方法培养的H.pylori菌进行尿素酶、氧化酶及触酶试验,结果均为阳性。结论:成功建立一种简便、有效的H.pylori液体培养法,细菌生长良好,且H.pylori形态变长。

幽门螺杆菌临床菌株的分离培养和鉴定

目的：建立一种幽门螺杆菌（H.pylori）临床菌株的分离培养的方法。方法：取临床胃黏膜组织标本88株,接种于10%绵羊全血的哥伦比亚选择性培养基上,37℃、5%O2、10%CO2、85%N2培养3-5 d后,挑取血平板上透明细小可疑菌落进行革兰氏染色和尿素酶试验,对阳性菌落进行扩大纯培养,提取细菌DNA,PCR扩增H.pylori 16sRNA、Cag A基因,电泳并进行测序鉴定。结果：成功从临床胃黏膜组织中分离培养出H.pylori,88例胃黏膜组织标本中分离培养并鉴定出H.pylori 19株,阳性率为22%;对16sRNA及Cag A基因进行扩增,电泳可见目的条带,并对16sRNA扩增产物测序,与H.pylori国际标准菌株26695比对,同源性为95%-99%。结论：37℃、5%O2、10%CO2、85%N2条件下10%绵羊全血的哥伦比亚选择性培养基上能成功分离培养出H.pylori临床株。