血红素加氧酶同工酶的结构与功能

血红素加氧酶(Hemeoxygenase,HO)是一种膜结合蛋白,哺乳动物体内共发现3种同工酶,HO 1、HO 2和HO 3.HO能催化血红素降解生成α 胆绿素,铁离子和CO.这些产物都有着重要的生理作用.对HO的结构和功能研究有助于人们正确认识其催化机理和生理意义.因此从HO的催化作用、HO同工酶、HO同工酶的活性部位及HO催化的区域选择性方面作一综述.

hHO—1结构预测及突变体的构建、表达、纯化和活性检测

人血红素加氧酶-1(human heme oxygenase-1,hHO-1)是血红素代谢的限速酶,直接调节体内胆红素水平。利用软件SPdbv程序对hHO-1进行结构模拟预测,以Ala取代第25位His残基,hHO-1活性部位的结构有较明显的改变,但据模拟推测突变后hHO-1与血红素仍然具有结合性。依据模拟结果,构建野生型和突变体表达载体pBHO-1和pBHO-1(M),并分别转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经30%-60%(NH_4)_2SO_4盐析后纯度提高3.6倍,再经两次Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂分离则表达产物的纯度提高30倍。酶活性测定显示,突变体hHO-1(△hHO-1)较野生型hHO-1(whHO-1)活性下降了91.21%。本研究显示hHO-1的第25位His在酶与底物血红素氧化反应中起着重要作用,为有效调控酶活性发挥其生物学作用提供依据。

制备hHO-1突变体以降低胆红素水平实验研究

目的制备人血红素加氧酶_1(humanhemeoxygenase_1,hHO_1)突变体,探讨酶的作用机制并应用突变体降低胆红素水平,为防治新生儿期高未结合胆红素血症的发生提供新途径。方法采用PCR方法制备hHO_1His25Ala突变体(hHO_1)cDNA,构建突变体表达载体pBHO_1(M)。野生型和突变体表达载体pBHO_1和pBHO_1(M)分别转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达目的蛋白。经30%～60%(NH4)2SO4盐析、Q_SepharoseFastFlow阴离子交换树脂分离纯化,并进行酶活性测定。结果构建的载体能分别表达产物,经30%～60%(NH4)2SO4盐析后纯度提高3.6倍,再经2次Q_SepharoseFastFlow阴离子交换树脂分离纯度提高30倍,酶活性测定显示,hHO_1较野生型hHO_1(whHO_1)活性下降了91.21%。结论hHO_1的第25位组氨酸在酶与底物血红素氧化反应中起着重要作用,制备的hHO_1能明显降低胆红素水平。

血红素加氧酶-1抗人血管内皮细胞凋亡的实验研究

目的 转染pcDNA3HO1入人血管内皮细胞（HUVEC）并表达，研究血红素加氧酶-1（HO-1）保护细胞凋亡的作用。方法 将构建好的质粒用DOTAP包裹转入细胞中表达：用CCLR破碎细胞后，SDS-PAGE鉴定表达量，采用TNF-α诱导细胞凋亡，以流式细胞仪测定细胞的凋亡率；采用Hemin和SnPP，分别刺激细胞，促进和抑制HO-l在细胞中的表达。结果 经Hemin处理后细胞的凋亡率均在20％以下，而SnPP处理后细胞的凋亡率大幅上升，最高可达到95％以上。实验数据显示HO-1基因表达被抑制时细胞凋亡率是诱导时的5～20倍。结论 细胞凋亡率与质粒转染效率和HO-l表达量均成反比，提示HO-l对细胞有保护作用，可以抑制细胞凋亡，存临床具有广泛的应用前景。