两种提取细胞外泌体方法的比较

近期研究发现外泌体在很多生理病理过程中起着重要作用,因而外泌体已成为当前的科研热点。本研究从外泌体形态、标志蛋白的表达方面比较了He La细胞外泌体的两种常用提取方法,以期获得更有效地提取Hela细胞中的外泌体方法。利用电镜观察两种方法提取的外泌体形态;动态光散射(dynamic light scattering,DLS)测定外泌体颗粒大小及分布,蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测外泌体标志蛋白CD63、CD81的表达。结果显示,差速离心法与PEG沉淀法所提外泌体都呈茶托样双层膜结构,直径约30~150 nm,无明显形态差异,外泌体标志蛋白正常表达,但PEG沉淀法要引入PEG,有可能影响外泌体生物活性,可见,差速离心法是一种更可靠的有效提取外泌体的方法。

NDV感染的HeLa细胞的外泌体microRNA的表达谱及生物信息学分析

分析经NDV感染HeLa细胞分泌外泌体microRNA表达变化,以期为外泌体microRNA在NDV感染中的具体作用机制提供初步的理论基础。采用经典差速离心法分离提取对照组与NDV感染组的HeLa细胞来源外泌体,经miRCURYTM Array芯片分析两组microRNA的表达谱后,通过Targetscan预测表达差异miRNA的可能靶基因,并利用DAVID、KEGG等在线预测工具对差异microRNA靶基因进行Go功能分析。相比于对照组,NDV感染组HeLa细胞外泌体中共有234个microRNA发生了2倍以上的表达差异(P<0.01),其中8个外泌体microRNA呈现出10倍以上的表达差异(P<0.01),分别为hsa-miR-3662、hsa-miR-3128、hsa-miR-345-5p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-106b-3p、hsa-miR-133b、hsa-miR-410-3p和hsa-miR-454-3p。经Go功能分析发现,这8个microRNA主要分布在细胞外膜、高尔基膜、细胞核膜等部位,参与转录过程,负调节RNA聚合酶Ⅱ启动子转录过程,蛋白质均聚过程,正调节NF-kappaB转录因子活性过程、细胞缺氧反应过程、神经元分化过程等,并发挥着蛋白结合、金属离子结合、转录因子活性、染色体结合等功能。NDV感染会引发HeLa细胞的外泌体microRNA显著性差异表达,而其机制仍有待进一步研究。

禽流感病毒H9N2与新城疫病毒在鸡成纤维细胞中共感染对病毒复制的影响

临床上禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)共同感染情况经常发生。为研究AIV与NDV在鸡成纤维细胞DF-1中的共感染对病毒复制的相互影响,首先对NDV和H9N2亚型AIV单独感染DF-1细胞时病毒的复制情况进行了分析,设定以NDV和AIV共感染细胞后12和24h作为样品采集点,通过Western blot、间接免疫荧光和实时荧光定量PCR检测了两种病毒共感染与单独感染对病毒NP蛋白表达的相互影响。结果显示:Western blot分析表明共感染12和24h,NDV NP蛋白的表达分别下调了70.6%(P<0.001)和45.7%(P<0.001),AIV NP蛋白的表达分别下调了61.5%(P<0.001)和82.8%(P<0.001);免疫荧光分析显示共感染组细胞中NDV和AIV的NP蛋白丰度在感染12h时间点分别下调81.1%(P<0.001)和65.5%(P<0.001),24h时则分别下调41.2%(P<0.05)和47.4%(P<0.001);qPCR结果也证实共感染12和24h组NDV NP的mRNA表达水平分别下调了64.3%(P<0.001)和64.4%(P<0.05),AIV NP的mRNA表达水平分别下调了61.5%(P<0.001)和63.0%(P<0.001)。本研究证明AIV与NDV共感染在细胞水平上可引起病毒复制的相互抑制,为研究NDV和AIV共感染机制在细胞水平上奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒GSTZ株E1基因原核表达载体的构建及表达

为研究牛病毒性腹泻病毒的囊膜糖蛋白E1的抗原性,参考了Oregon C24V BVDV毒株的基因组序列(AF091605.1),并设计一对特异引物(上游引物5’-CCC GGA TCC ATG GCC TCT CCC TAC TGT-3’,下游引物5’-GGG CTC GAG TTA CCC TTG TGC TCC TGT T-3’),利用RT-PCR从病毒基因组中扩增E1基因609 bp全长片段,测序结果表明,与C24V株核苷酸同源性达100%.扩增产物经BamHI和XhoI双酶切,亚克隆至原核表达载体,双酶切鉴定表明成功构建了重组表达载体pET-32a(+)-E1.重组表达载体转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot检测,成功诱导表达出25ku E1蛋白.实验结果为进一步研究BVDVE1蛋白的功能提供了参考.

RNA病毒利用外泌体促进病毒感染的研究进展

外泌体是一种由细胞主动向胞外分泌的囊泡类小体,因其能在细胞间传递蛋白、脂类和核酸等分子,而被认为是一种新的重要的细胞间通讯方式。RNA病毒,如HIV-1、HCV等,作为一类重要的病原体,一直影响着全人类的健康。近来的研究发现,病毒能够利用外泌体的某些相关功能促进其复制与传播。然而,对外泌体与病毒感染的相关研究才刚刚起步,尚有很多方面并未被详细认知,所要研究的内容还有很多。本文主要总结了外泌体在一些RNA病毒感染中的促进作用及其可能的机制,以期让大家了解RNA病毒与外泌体之间已有的相互关系。

新城疫病毒调控宿主YB-1蛋白的初步研究

为了揭示YB-1蛋白在新城疫病毒(NDV)感染中的作用,对NDV感染细胞中YB-1表达水平以及亚细胞定位的变化进行了初步探索。利用RT-PCR技术,从鸡胚成纤维细胞中扩增了鸡源YB-1蛋白基因,序列分析结果显示其与其他物种YB-1有较高的相似性,与人YB-1的核苷酸和氨基酸相似性分别为88.3%和78.9%。随后利用间接免疫荧光技术检测了感染NDV强毒株Herts/33的He La和DF-1细胞中内源性YB-1蛋白的亚细胞定位变化,用q RT-PCR方法检测了YB-1 m RNA表达水平,通过Western-blot检测了YB-1蛋白水平的时相变化。结果显示,He La细胞中YB-1主要存在于细胞质,而禽源DF-1细胞YB-1集中在细胞核内;感染NDV后,两种细胞中的YB-1蛋白均在细胞质内呈现颗粒化聚集,同时在NDV感染后期He La细胞中YB-1蛋白出现少量降解。该研究初步揭示了NDV感染过程中YB-1蛋白的迁移现象,推测与NDV的复制过程相关,其具体的作用机制以及对NDV复制的影响尚待更深入的研究。