紫花苜蓿MsBBX20基因克隆及耐盐功能分析

BBX家族转录因子参与光形态建成、成花生理、避荫反应、种子生长发育、激素信号转导及对逆境胁迫的响应等植物重要生长发育过程。紫花苜蓿是耐盐性较强的牧草饲料作物,其品质优良,有“牧草之王”的美誉。发掘并探索紫花苜蓿MsBBX20基因响应非生物胁迫的分子机理,有助于揭示紫花苜蓿抗逆生物学基础,为紫花苜蓿抗逆分子育种提供新的基因资源。通过RT-PCR、3'/5'RACE PCR技术克隆得到MsBBX20基因cDNA序列,生物信息学分析发现其CDS全长834 bp,编码278个氨基酸,该基因编码的蛋白质为锌指结构蛋白家族成员。利用qRTPCR技术分析MsBBX20在紫花苜蓿不同组织和不同非生物胁迫下的表达模式。通过基因枪轰击技术,在洋葱表皮瞬时表达MsBBX20进行亚细胞定位。克隆得到大小为1737 bp的MsBBX20启动子序列并分析了顺式作用元件,该启动子可驱动GUS报告基因在烟草的叶、茎和根中高效表达。将MsBBX20启动子序列与包含GUS基因的pCAMBIA-1301载体连接,瞬时转化烟草并通过组织化学染色对不同组织进行GUS活性分析。构建pCAMBIA3301-MsBBX20植物超表达载体,通过农杆菌介导的方法遗传转化野生型拟南芥,获得超表达MsBBX20的拟南芥株系。用不同浓度盐溶液(150、200和300 mmol·L^(-1)NaCl)处理拟南芥转基因株系并分析其MDA含量和抗氧化酶活性。进化分析表明紫花苜蓿MsBBX20蛋白与红三叶TpBBX20的亲缘关系最近。MsBBX20蛋白定位于细胞核。MsBBX20基因在花中表达量最高,且MsBBX20可以响应干旱、盐、冷、脱落酸、赤霉素、光照等多种非生物胁迫。遗传转化获得MsBBX20过表达拟南芥株系,并选择3个高表达阳性株系进行功能验证。在不同浓度NaCl处理条件下,过量表达MsBBX20的拟南芥株系的丙二醛(MDA)含量显著低于对照,而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性均显著高于对照。克隆获得紫花苜蓿锌指蛋白转录因子基因MsBBX20,该基因在花中表达量最高,能够响应多种非生物逆境胁迫和外源激素处理,表明MsBBX20可能参与紫花苜蓿的多个逆境响应过程。进一步的研究证明MsBBX20可能通过调节植物的抗氧化酶系统,缓解逆境造成的植物细胞氧化损伤,提高转基因拟南芥对盐胁迫的抗性,进而增强植株的耐盐性。

呼伦贝尔黄花苜蓿MfMYB30基因的克隆及表达分析

该研究在呼伦贝尔黄花苜蓿(Medicago falcata L.cv.Hulunbuir)转录组测序基础上,通过RT-PCR方法克隆获得了MfMYB30基因,并通过生物信息学和表达分析进行初步研究,为深入研究MfMYB30基因的功能和开发利用奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得呼伦贝尔黄花苜蓿MfMYB30基因,其ORF序列长为957 bp,编码318个氨基酸,相对分子质量为86.85 kD,理论等电点为5.11。MfMYB30蛋白为疏水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽序列。(2)系统进化分析表明黄花苜蓿MfMYB30蛋白与紫花苜蓿MsMYB4、拟南芥AtMYB30、木豆Cc-MYB30、蒺藜苜蓿MtMYB30和大豆GmMYB60聚为一个类群,亲缘关系较近。(3)实时荧光定量PCR结果显示,MfMYB30在黄花苜蓿模拟刈割不同天数后的相对表达量呈先降低后升高的趋势,在刈割7 d后相对表达量达到峰值。(4)通过在拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该蛋白定位于细胞核。研究推测,MfMYB30基因可能在黄花苜蓿刈割或放牧胁迫响应过程中发挥重要调控作用。

黄花苜蓿研究进展

在论述黄花苜蓿植物学特征与生物学特性的基础上,综述了黄花苜蓿在再生性、耐牧性、抗寒性、抗旱性和耐盐性方面的研究进展,并展望了今后的研究方向,以期为黄花苜蓿的品种改良提供参考。

野大麦研究进展

野大麦是一种抗逆性较强、产量及营养品质较高的优质牧草,加之内生真菌的存在其耐盐性进一步加强,成为生态改良中的优良草种,但缺点是落粒性较强。在概述生物学特性的基础上,从野大麦内生真菌及其共生体研究、落粒性研究、耐盐性研究、产量及营养品质研究方面综述了国内外研究现状,并展望了今后的研究方向。

柳枝稷木质素基因F5H的高效编辑

柳枝稷(Panicum virgatum)是重要的C4多年生木质纤维素类生态能饲草。为了快速创制细胞壁转化效率高的能饲草新资源,以异源四倍体柳枝稷品种Alamo为材料,克隆了其木质素合成途径的阿魏酸-5-羟基化酶基因PvF5H,并根据其序列设计编辑靶点,用于构建CRISPR/Cas9-PvF5H编辑载体,最后通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法,获得了59株柳枝稷转基因阳性植株。测序分析表明,PvF5H在94.9%的转基因植株中被编辑,纯合编辑效率为55.4%。该研究建立了高效的柳枝稷基因编辑系统,实现了对细胞壁品质相关靶基因的有效编辑,为今后能饲草新品种的培育奠定了基础。

野大麦高效组培快繁及农杆菌介导的愈伤侵染体系建立

野大麦(Hordeum brevisubulatum)为禾本科大麦属多年生草本植物,具有较强的抗寒和耐盐碱能力,是挖掘抗逆基因的优良种质资源。但目前尚未见野大麦遗传转化体系的报道。该研究以蒙农1号杂交野大麦成熟胚为外植体诱导愈伤组织,建立了野大麦高效组培快繁体系,分化率达70%,快繁系数为35。在此基础上,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株侵染筛选获得的高质量愈伤系YZ101,通过优化侵染条件使侵染率接近30%。该体系的建立为野大麦功能基因组研究与分子设计育种奠定了基础。

5种冰草叶绿体基因组密码子偏好性分析

本研究从5种冰草叶绿体基因组中各筛选出52条蛋白编码序列,利用CodonW、SPSS、EXCEL等软件对其进行密码子偏好性使用模式分析。结果显示,在RSCU分析结果中,共有31个高频密码子,有28个是以A/U结尾,密码子偏好性在冰草叶绿体基因组中的表现较弱。中性分析结果显示,自然选择在冰草叶绿体基因组密码子偏好性发挥作用;在有效密码子数的结果中,偏好性多受突变影响;PR2-plot分析结果,大部分基因由选择调控。此外筛选出8个高频高表达的最优密码子,分别为CGA、UUG、UCA、GAU、UUU、UCC、GGA、ACA。冰草叶绿体基因组密码子偏好性种间差异不显著,且根据中性分析、ENC-plot、PR2-plot分析密码子偏好性可能受多种因素共同作用。最优密码子的选择,为冰草叶绿体基因组工程中外源性基因表达效率的提高奠定基础。