RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的种子特异性分析

为研究RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的效果及其器官特异性,实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7天、第14天、第21天、第28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。结果显示:对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21天、第28天较对照Westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与Westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸平均含量达到81.5%较Westar增加了近15%,而多不饱和脂肪酸平均含量为5.25%,较Westar下降了近70%;但根、茎、叶中的脂肪酸含量二者无显著差异;结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21d左右,表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。

核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建

真菌多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)能够特异性识别真菌分泌的降解植物细胞壁的主要物质多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性。目前,酵母双杂交技术是快速、有效获取植物PG IP的主要途径,而其前提是要获得真菌PG的酵母诱饵载体。本研究以核盘菌的PG cDNA为模板,经PCR扩增获得1 125 bp片断,进一步将其克隆到pEASY-T1载体上。以克隆了目的基因的pEASY-T1质粒为模板,用含NdeⅠ和SalⅠ位点的引物对PG-F2/PG-R2扩增获得1 125 bp大小的目的片段,将其连接到pEASY-T1上生成pEASY-PG。用NdeⅠ和SalⅠ双酶切pEASY-PG,回收1 125 bp片段并连接到诱饵载体pGBKT7相应的酶切位点上,转化大肠杆菌菌株DH5α。在含有卡那青霉素的LB平板上筛选获得重组质粒。经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后获得预期的1 125 bp DNA片段,表明诱饵蛋白载体pGBKT7-PG6构建成功。应用醋酸锂介导法将pGBKT7-PG6转化酵母菌株Y187,经激活培养基上培养检测,未发现蓝色菌落,表明酵母转化子自身不具有自激活功能,可用于大规模筛选经核盘菌诱导的cDNA表达文库。

核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁RS-1的SSH文库构建

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)对幼苗进行接种,提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正向消减文库是以诱导后的宁RS-1 cDNA为tester,以正常的宁RS-1 cD-NA为driver。所构建的正向文库重组率达到96.2%,反向文库重组率达到94.5%,文库容量均达到了2 190和2 780,表明所构建的文库质量良好。对从文库中随机挑取的克隆进行测序分析,获得了与抗病和代谢有关的基因,如γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因、抗真菌蛋白基因、铁蛋白基因、ACC氧化酶基因等,为开展油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。

甘蓝型油菜CRABS CLAW基因克隆及其RNA干扰载体的构建

CRABS CLAW(CRC)转录因子是YABBY基因家族成员,在植物花器官发育过程中起重要作用。为进一步研究CRC转录因子在调控油菜花器官发育过程中的作用,本研究以甘蓝型油菜品种宁油10号花蕾RNA为材料,通过反转录PCR克隆到1个580 bp长度的CRC基因,并利用p Hurricane中间载体构建CRC基因的反向重复序列表达框,将CRC基因片段以正向的方式连接在1个可剪切的内含子的5'末端,以反向的方式连接到该内含子的3'末端;然后将Ca MV35S启动子序列和CRC基因的反向重复表达框再克隆到植物双元载体p CAMBIAI1390的p UC18多克隆位点,构建了干扰表达载体p A6-CRCi,经过酶切鉴定和测序分析,所构建的载体正确。

长江下游甘蓝型油菜种质耐湿性鉴定

渍害是长江下游多发性气象灾害,严重影响油菜产量。通过对适合长江下游种植的60份甘蓝型油菜种质进行耐渍性筛选,为耐渍性品种选育和生产者选择品种提供依据。在露白期和子叶期进行室内淹水处理,考察油菜种质的耐渍性及耐渍性指标。结果表明,淹水后油菜的相对成苗率、相对茎长、相对根长和相对单株鲜质量均不同程度下降。不同种质的耐渍性差异较大,同一品种在不同时期淹水耐渍性也有差异,受试材料中强耐渍的材料有3份(P1、P39和P47),占总品种的5%;较强耐渍的材料11份(P5、P7、P12、P17、P24、P25、P26、P27、P29、P33和P42),占18.3%。依据上述2种方法的筛选结果,选取9份材料进行田间鉴定。结果表明,3叶期渍害处理后,单株有效分枝数、有效角果数、每角粒数及产量下降,千粒质量增加,P1、P39和P47表现突出,受淹水时期影响较小,与露白期、子叶期的鉴定结果高度一致。相关性分析表明,不同种质苗期各性状湿害指标与成熟期产量性状相关性大部分达到显著或极显著水平,有利用潜力。综上,通过室内淹水处理,考察油菜种子的相对成苗率和相对根长可便捷有效地鉴定甘蓝型油菜耐湿性,提高筛选效率。

油菜(Brassica napus L.)BnPGIP基因克隆及其表达分析

以油菜品系甘蓝型油菜宁RS-1为植物材料,以南京油菜田里收集的核盘菌为致病菌,根据已经报道的油菜PGIP基因序列,设计简并引物。从宁RS-1基因组DNA中经PCR克隆到1条包含1个内含子与2个外显子的基因序列。序列比对分析显示,该基因与已公布的油菜PGIP1基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达99%,编码区序列全长984 bp,编码332个氨基酸,富含亮氨酸。以翻译延伸因子EF-1α作为内标,利用半定量RT-PCR分析了BnPGIP基因在核盘菌未诱导和诱导后宁RS-1中的表达量差异。结果发现,核盘菌诱导后宁RS-1中的BnPGIP表达含量明显提高,表明宁RS-1在受到核盘菌侵染后体内的BnPGIP基因受到诱导表达。为进一步研究BnPGIP基因在抗核盘菌侵染的作用,构建了BnPGIP基因过量表达载体。

甘蓝型油菜-核盘菌酵母双杂交cDNA文库构建及BnJar1互作蛋白筛选

油菜与核盘菌相互作用的过程中,JA(茉莉酸)合成相关基因表达量升高,但是JA信号传递却受到了抑制,推测核盘菌分泌的效应蛋白可能直接或间接作用于JAR1蛋白,使其活性降低,从而抑制依赖JA途径的油菜防御系统。前期通过转录组测序获得了差异表达基因BnJar1全长序列,为进一步揭示BnJar1基因参与油菜-核盘菌相互作用过程的机理,本研究对BnJAR1蛋白进行生物信息学分析和预测,构建了核盘菌-油菜互作表达基因酵母文库,并以BnJar1作为诱饵蛋白对文库进行酵母双杂交筛选,获得了5个来自油菜的互作蛋白:丙二烯氧化物环化酶2(BnAOC2)、COP9信号复合物(BnCOP9)、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶(BnDcoH)、腈水解酶2(BnNIT2)和茎特异性蛋白(BnTSJT1);2个来自核盘菌的互作蛋白:MFS结构域蛋白(SsMFS)和Rho3 GTP酶(SsRho3)。相关结果为研究油菜-核盘菌的相互作用,挖掘致病或抗病相关基因,进一步解析其机理奠定了基础。

超高产油量油菜品种宁杂182的选育和栽培要点

宁杂182属甘蓝型油菜中早熟类型,选自16’8006×16’8036组合。国家油菜试验结果为,株高平均169.76 cm,有效分枝平均9.01个,单株总角数平均395.90个,角果中长,每角粒数平均23.35粒,千粒质量平均4.31 g,芥酸含量平均0.14%,硫苷含量平均22.60μmol/g,含油量平均50.09%,生育期平均217.3 d。2 a平均产量3180.30 kg/hm^(2),比对照增产11.80%,平均产油量1578.38 kg/hm^(2),比对照增产21.25%。2 a平均菌核病发病率17.47%,平均病情指数8.99;2 a平均病毒病发病率0.67%,平均病情指数0.38。宁杂182适合机收。

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R等位基因特异PCR标记的开发与应用

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R是从抗性突变体M9中克隆获得,抗性基因BnALS1R与野生型基因BnALS1存在1处SNP,即乙酰乳酸合酶第638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。为获得油菜抗除草剂基因BnALS1R的分子标记,根据该处点突变,结合获得的BnALS3与BnALS1序列,开发30条等位基因特异PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)引物,采用筛选出的3条AS-PCR引物在F2、BC1和BC2群体中进行PCR扩增。结果表明,该标记有效检测出群体中存在的3种基因型,其分离比分别为1∶2∶1、1∶1、1∶1,均遵循单基因遗传规律。应用该标记对获得的抗性恢复系进行PCR扩增,结果发现所有抗性恢复系均能扩增出抗性基因BnALS1R目的条带,表明3条标记引物可应用于抗性基因的检测。AS-PCR标记的获得将促进以抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种。

苗期喷施烯效唑对油菜生长及产量和品质的影响

为探索烯效唑在油菜机械化种植中的应用，2～4叶期用50 mg／L、75 mg／L、100 mg／L和150 mg／L的烯效唑喷施油菜幼苗（1或2次），研究烯效唑对幼苗生长调控、光合生理特性、植株抗倒性及其产量和品质的影响。结果显示：幼苗株高、最大叶面积和地上部干质量均随处理浓度和次数的增加而显著下降；当处理浓度≤100 mg／L，根干质量和根颈粗随处理浓度增加而增加。幼苗高、最大叶面积和根干质量随烯效唑处理时苗龄的增大而增加。叶片净光合率和叶绿素含量随处理浓度和次数的增加而增加。成熟期的株高和分枝点高度均随烯效唑处理浓度和次数的增加而降低，而根颈粗、根干质量和单位长度茎秆干质量增加，植株抗倒能力增强。烯效唑浓度≤100 mg／L，处理1次，单株角果数、千粒质量和种子产量增加。2～4叶期叶面喷施不同浓度烯效唑，种子含油量下降，蛋白质含量增加，脂肪酸组成及相对含量无明显变化。2叶或3叶期用≤100 mg／L烯效唑处理幼苗，可有效降低成熟期株高，增强植株抗倒性，有利于机械收获。

种植密度和施氮量对油菜产量、品质及机收性状的影响

为研究施氮量与种植密度对油菜机收性状及产量和品质的影响,以宁油20号为试验材料,设置施纯氮量240 kg/hm^2、300 kg/hm^2、360 kg/hm^2,以及种植密度1 hm^23.00×10~5株、3.75×10~5株、4.50×10~5株、5.25×10~5株、6.00×10~5株不同处理。结果表明,高施氮量能获得最高的籽粒产量与产油量,但籽粒产量的增加幅度大于产油量,产油量在不同施氮量间差异不显著。改变施氮量与种植密度对经济性状、产量构成因素均可产生显著影响,其中密度间差异对主要经济性状的影响超过施氮量的差异,施氮量差异对产量构成因素的影响超过密度间差异。随施氮量增加含油量和硫苷含量下降。籽粒脂肪酸组成比较稳定,但芥酸含量随施氮量增大而增加;油酸含量随施氮量增大而降低。株高随施氮量增加升高不明显,随密度增加而降低;低氮量高密度种植能获得较高分枝点高度;分枝数随施氮量减少而减少,随密度增大而减少。因此,若以减少施肥、节本增效为前提,选择施纯氮240 kg/hm^2,并且在1 hm^23.00×10~5~6.00×10~5株范围内提高密度,有利于获得高产油量和机收性状的形成。

甘蓝型油菜异分支酸合酶基因的克隆及信号通路相关基因的诱导表达

为了解异分支酸合酶1(ICS1,水杨酸合成的限速酶)在甘蓝型油菜抗病过程中的功能,以甘蓝型油菜耐菌核病品种宁RS-1为材料,在核盘菌侵染时,研究甘蓝型油菜ICS1基因和水杨酸信号通路相关基因的诱导表达。首先利用同源序列法克隆得到宁RS-1中ICS1基因的c DNA序列,命名为Bn ICS1。Bn ICS1序列全长1 719bp,编码572个氨基酸残基,含有1个分支酸结合域。表明油菜中也存在异分支酸途径。接种核盘菌前、后及不同时期荧光实时定量PCR结果发现Bn ICS1在核盘菌接种后6hpi(接种后6h)表达量升高,但是24hpi后降低;而MPK4基因的表达量在6hpi降低,24hpi后升高,说明SA合成先是被核盘菌诱导,但随后又被抑制。EDS5基因和PR1基因表达量从接种后6hpi持续升高,而PDF1.2基因的表达量不断降低,说明SA信号通路最终受核盘菌诱导形成病斑,而茉莉酸途径及其诱导的植物防御反应受到抑制。

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA 干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Not I和Xho I酶切,酶切产物连接到RNAi平台载体pHurricane的Not I和Xho I位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。

优质化学杀雄两系杂交油菜宁杂1818的选育

宁杂1818属甘蓝型油菜中晚熟品种类型,选自“宁油18×088018”组合,其株高178.73 cm,分枝点较高。一次分枝6.48个,主轴约长60 cm左右,单株角果数257.60个,角果长6~7 cm,果喙较长。每角种子数22.05粒,千粒重4.09g;芥酸含量0.50%,硫苷含量19.71μmol/g,含油量45.54%。国家油菜区域试验结果,平均产量3110.40 kg/hm2,比对照增产4.14%;生产试验结果,宁杂1818比对照增产5.95%。该品种抗病毒病,较抗菌核病,抗倒伏能力强。

转基因高油酸油菜株系W-4种子脂肪酸组成

为研究fad2基因下调表达对油菜种子脂肪酸组成的影响,分析比较了转基因高油酸油菜品系W-4的T5、T6和T7种子以及非转基因对照Westar种子中的脂肪酸组成。数据显示W-4种子中油酸平均含量为84.61%±1.41%,较对照增加了25.91%,达到极显著水平;亚油酸和亚麻酸含量分别为3.22%±0.56%和3.45%±0.51%,较对照分别下降了80.89%和47.00%,降幅均达极显著水平。此外,W-4种子中棕榈酸平均含量为3.42%±0.18%,较对照Westar下降18.10%,达到极显著水平;而硬脂酸平均含量为1.87%±0.19%,较对照下降了8.33%,亦达到显著水平;W-4种子中廿碳烯酸的平均含量为1.54%±0.06%,较对照平均增幅为18.46%,达到极显著水平;W-4平均芥酸含量较对照略有增加,但不显著。结果表明油菜种子中fad2基因下调表达对种子的脂肪酸合成与积累影响较大,其不仅显著降低种子中多不饱和脂肪酸含量,增加油酸的含量;而且也显著降低饱和脂肪酸含量,并促进长链单烯酸的合成。

甘蓝型油菜离体培养再生体系的优化

为优化甘蓝型油菜离体培养再生体系,本研究分析了影响再生频率的多个关键因素,包括品种、外植体类型、苗龄、预培养时间以及激素浓度与配比等。结果表明:品种对再生频率影响较大,Westar的外植体再生频率高于宁油18号和中双11号;不同外植体再生频率也存在差异,子叶柄的再生频率显著高于下胚轴;苗龄以4 d较好,预培养时间以2 d较适宜;预培养基中激素2,4-D最适浓度为1 mg/L,分化培养基中,6-BA/NAA比例为10∶1时子叶柄的再生频率最高,为70.79%,6-BA/NAA比例为9∶1时下胚轴的再生频率最高,达到96.73%。经过优化后,油菜外植体再生频率得到显著提高。

转基因油菜 W-4 fad_2基因沉默的种子特异性分析（英文）

目的]研究转基因油菜W-4的种子fad2基因受RNAi干扰的效果及其器官特异性。[方法]采用实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7、14、21、28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。[结果]对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21、28 d较对照westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸脱饱和指数(ODP)平均为0.07较Westar的0.24下降了75%;但越冬期根、茎、叶中的油酸脱饱和指数两者无显著差异。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21 d左右。[结论]结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。

烯效唑浸种和基质配比对油菜秧苗质量的影响（英文）

[目的]为培育适合全自动机械移栽的毯状油菜苗,以HY4为材料,探讨烯效唑浸种和不同基质配比对油菜种子萌发及育苗质量的影响。[方法]以7个不同浓度（0、5、10、20、30、40和50 mg/L）的烯效唑溶液分别浸种0、1、2、4和8 h,自然晾干。经培养皿室内试验筛选,得到适宜的烯效唑浸种浓度和时间。以5个浓度（0、5、10、15、20 mg/L）分别浸种0、1和2 h进行室外盆钵试验,同时进行毯状菜苗的育苗基质配比筛选,在油菜适宜播期进行水稻秧盘育苗验证试验。[结果]培养皿试验结果表明,烯效唑浸种可延缓种子萌发,降低种子发芽率,抑制胚轴伸长,并促进根系生长。当浸种浓度大于30 mg/L或浸种时间超过2h,则对种子萌发影响较大且抑制根系生长。室外盆钵试验结果表明,4个烯效唑浸种浓度和时间能够有效降低苗高、延缓地上部生长、促进地下部生长,有利于培育高密度毯状机械移栽苗。育苗基质配比试验中,土壤配比量越少,越有利于幼苗生长,发芽率、株高、根系活力和干物质重增加,差异达到显著水平（P〈0.05）。油菜适宜播期水稻秧盘育苗试验结果与盆钵试验一致。烯效唑浸种浓度≤10 mg/L、浸种时间〈1 h时,对幼苗生长调控能力较弱,幼苗偏高。基质中土壤配比量〈50%时,肥力充足,相对弱化了烯效唑对幼苗生长的调控,幼苗较大。[结论]用15~20 mg/L烯效唑浸种1~2 h,育苗基质中土壤配比量为50%,可培育苗高≤18 cm、保有叶片5~6张、苗龄30~40 d的毯状机械移栽苗,实现工厂化生产。

高产、高油甘蓝型油菜宁油22的选育与栽培要点

宁油22是从甘蓝型油菜品种宁油12号中经系统选育而成的常规油菜新品种,属甘蓝型油菜中熟品种类型。株高162.20 cm,一次分枝9.22个,二次分枝8.46个。结角密,单株有效角果数424个,角果中长。每角种子数20.02粒,千粒质量3.72 g。芥酸含量0.21%,硫苷含量20.91μmol/g,含油量45.17%。全生育期244.2 d,比对照早熟0.5 d。江苏省油菜区域试验结果表明,平均产量2 896.43 kg/hm2,比对照增产3.82%。生产试验结果表明,宁油22比对照增产13.03%。菌核病抗性中等,抗倒性强,抗寒性中等,适合机收。

优质化学杀雄两系杂交油菜“宁杂1838”的选育

宁杂1838属甘蓝型油菜中晚熟品种类型,选自096030×096033组合。株高168.50 cm,分枝点较高,一次分枝8个。单株角果数333.50个,每角种子数22.90粒,千粒质量4.10 g;芥酸含量0.60%,硫苷含量24.13μmol/g,含油量44.28%。国家油菜区域试验结果,平均产量3 091.80 kg/hm^2,比对照增产5.73%;生产试验结果,宁杂1838比对照增产10.30%。该品种抗病毒病,较抗菌核病,抗倒伏能力极强。