猪盖塔病毒感染性克隆构建及病毒拯救

为研究盖塔病毒(GETV)致病机制,需搭建可靠的盖塔病毒(GETV)反向遗传操作平台。首先构建GETV/HuN1株的全长感染性克隆质粒,并在nsP4基因与C基因之间或E1基因与3′UTR之间插入亚基因组启动子26S和报告基因EGFP,将3个重组质粒分别转染至BHK-21细胞中,拯救病毒,鉴定重组病毒和外源基因稳定性,测定病毒滴度并绘制生长曲线。以重组质粒pACYC-177-GETV为模板进行RT-PCR扩增,结果显示,GETV每个蛋白基因均能正确扩增出相应条带。IFA鉴定结果显示,E2与6K蛋白抗体能与rGETV特异性结合。将EGFP基因分别插入到C基因的上游或E1基因的下游,产生报告病毒rGETV-EGFP/C和rGETV-EGFP/E1。在2种报告病毒感染的BHK-21细胞上均能观察到EGFP高表达,将报告基因插入E1基因下游,可保持其更高的稳定性。此外,生长曲线显示,重组病毒具有与亲代病毒相似的生长速度。综上,GETV反向遗传操作平台的成功建立为研究GETV蛋白功能和研发疫苗奠定了基础。

盖塔病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备盖塔病毒(GETV)E2蛋白单克隆抗体,通过大肠埃希菌表达系统表达重组E2蛋白,经过镍柱吸附、切胶纯化,获得E2蛋白,将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,3次免疫后加强免疫,细胞融合,通过间接免疫荧光筛选阳性杂交瘤细胞,最终筛选出1株针对GETV E2蛋白的阳性杂交瘤细胞9E8,将该杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔内生产腹水。经间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验鉴定,该单抗可与GETV发生特异性反应。经IP试验证明,该单抗可识别天然结构的GETVE2蛋白。对E2单抗进行抗原表位鉴定,确定其所识别的多肽序列为66KIRYIAGHD74。与GenBank上登录的其他GETV毒株序列对比,发现该段序列高度保守。综上,E2单抗9E8免疫学反应特性良好,为研究该病毒提供了有效的免疫学检测工具。