氟化钠诱导人成骨细胞凋亡相关microRNA差异表达及分析

背景:长期过量摄入氟,尤其是通过饮水,可以引起慢性氟中毒骨病。该病可以导致骨骼损伤和畸形,且难以恢复。目前还没有早期诊断该病的无创或微创方法。目的:观察人成骨细胞在过量氟作用下凋亡相关mi RNA表达的情况。方法:体外培养人成骨细胞建立染氟模型,用20 mg/L Na F和40 mg/L NaF分别处理24/48 h后用PCR芯片法测定凋亡相关mi RNA的表达情况。结果与结论:(1)Na F处理24 h后发现成骨细胞内有48条mi RNA表达上调,4条mi RNA表达下调;Na F处理48 h有21条miRNA表达上调,2条miRNA表达下调;两个时间点共同上调mi RNA有9条,共同下调miRNA有1条;(2)用生物信息学软件对选出的10条人成骨细胞凋亡相关miRNA进行靶基因分析,涉及抗凋亡和促凋亡的两方面的作用,对于氟骨症的早期鉴别具有一定的理论意义。

构建TRAF6基因3’非编码区荧光素酶报告质粒验证及与潜在靶基因TRAF6的靶向关系

背景:前期研究发现miR-146-5p在染氟成骨细胞凋亡时表达上调。目的:构建肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)基因3’非编码区(3’UTR)荧光素酶报告质粒,利用双荧光素酶报告基因验证miR-146-5p与其潜在靶基因TRAF6的靶向关系。方法:采用生物信息学方法预测mi R-146-5p与TRAF6基因的结合位点。采用PCR技术扩增TRAF6基因3’UTR片段,并克隆至p Yr-MirTarget载体,构建野生型重组双荧光素酶报告质粒。实验分6组:①6a-5p-核苷类似物+TRAF6野生型3’-UTR共转组;②无核苷类似物对照+TRAF6野生型3’UTR共转组(对照组);③miR-146a-5p-抑制剂+TRAF6野生型;④TRAF6野生型3’-UTR转染组;⑤p Yr-MirTarget空质粒转染组;⑥正常细胞组。分别将重组荧光素酶报告质粒与miR-146-5p和核苷类似物共转染Saos-2,同时设置无核苷类似物对照、miR-146-5p抑制剂阴性对照和空载p Yr-MirTarget-W3’UTR、TRAF6-W 3’UTR及正常对照。检测6组细胞中荧光素酶活性。将核苷类似物和miR-146-5pinhibitor以及无核苷类似物对照分别转染人成骨细胞Saos-2,裂解细胞提取蛋白后采用免疫印迹检测TRAF6蛋白表达水平。结果与结论:①共转染miR-146-5p mimics的Saos-2细胞中荧光素酶活性为10.103 0±0.558 5、对照组(无核苷类似物-TRAF63’UTR)荧光素酶活性为13.1400±0.7204、抑制剂(inhibitor)组荧光素酶活性为13.707 1±0.434 8、野生型TRAF6 3’UTR质粒的Saos-2细胞中荧光素酶活性为13.202 1±0.456 5。仅转染空质粒的细胞荧光素梅活性为14.706 2±0.441 6,Saos-2细胞中荧光素酶活性本底值为1.126 4±0.126 2。共转染miR-146-5p mimics组明显降低(F=715.789,P <0.000 1),其他3组间与对照组比较,差异无统计学意义(P> 0.05);②免疫印迹结果显示,与对照组比较,细胞转染miR-146-5p mimics后TRAF6蛋白表达水平明显下调;③结果说明,TRAF6与mi R-146-5p存在靶向关系。