哺乳动物凝集素及其生物学作用

哺乳动物凝集素及其生物学作用周柔丽（北京医科大学细胞生物学教研室，北京１０００８３）关键词动物凝集素，细胞识别自Ａｓｈｗｅｌｌ和Ｍｏｒｅｌｌ发现肝细胞凝集素廿余年来在高等动物体内陆续发现了多种多样的凝集素。其生物学作用涉及到许多重要的生理与病理活动，...

纤维粘连蛋白和层粘连蛋白与疾病

近年,细胞外基质(extracellalarmatrix,ECM)在正常生命活动中的重要作用逐渐被揭示。不同组织和器官中的ECM成分不同,并随分化、发育、生理及病理状况而变动。因而ECM成分是动态的执行着重要的生物学功能的。每一类ECM成分都有很多种。其中以非胶原糖蛋白的种类居多。至今已发现数十种。在结构上。

层粘连蛋白总糖肽的抗癌细胞转移作用及其作用机制

增殖失控及侵袭与转移是恶性肿瘤细胞的根本特性,也是夺去癌患者生命的根本原因。不单在癌症发展过程中可自发的发生广泛转移,而且在癌症常规诊疗过程中也有可能人为的促进癌细胞的转移(医源性转移),如诊疗操作中的种植及对患者免疫功能的损伤等。癌细胞转移是一个多步骤的复杂过程。然而。

人肝癌相关新基因编码产物LAPTM4B的鉴定及其生物学特性

目的 :鉴定由肝细胞癌 (HCC)相关新基因LAPTM 4B编码的蛋白质并研究其生物学特性。方法 :以Westernblot、免疫组化及双向电泳鉴定新基因的表达产物 ;以免疫共沉淀等方法研究分子间的相互作用。结果 :LAPTM4B基因编码相对分子质量分别为 35× 10 3 和 2 4× 10 3 、等电点分别为 9.0 7和 4 .6 5的两种异型分子。它们在肝癌组织及肝癌细胞系的表达显著上调 ,而相对分子质量为 35× 10 3 者尤为明显 ,并与细胞分化程度相关。LAPTM4B蛋白可与整合素α 6亚单位及表皮生长因子 (EGF)受体形成信号复合物。结论 :LAPTM4B 35蛋白在人肝癌组织及细胞系过表达 ,并可能通过与细胞表面的整合素受体及EGF受体形成复合物而参与细胞外基质成分所启动的信号转导。

从血液中提取总RNA的一种快速高效方法

血液中含有大量的RNA酶 ,可引起RNA的降解 .防止RNA酶的降解 ,是保证所得RNA片段完整的关键 .目前提取RNA的方法较多 ,但有些方法尚不能完全防止RNA降解 .将TRIZOL方法稍加改进 ,将TRIZOL与异硫氰酸胍联用提取血液淋巴细胞总RNA .琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,其 2 8SRNA与 18SRNA的比值为 2∶1,优于单独使用其中任何一种试剂者 .此方法同样适用于从其它细胞中提取RNA .

人肝细胞癌及其配对非癌肝组织、正常肝组织中热休克蛋白Hsp90基因mRNA水平的分析

为定量分析和比较 2 2对人肝细胞癌 (HCC)及其配对非癌肝组织 (PNL)和 2例正常肝 (NL)组织中热休克蛋白Hsp(heatshockprotein) 90基因mRNA的表达水平 ,用狭缝杂交法检测hsp90 βmRNA的表达 ;并进一步用以特异性复合cRNA为内参照的定量RT PCR法对hsp90α和hspβmRNA的表达进行分析比较 .狭缝杂交结果显示 ,hsp90 βmRNA在 1 3例 ( 59 1 % )PNL中的表达平均升高至NL的 1 87倍 ;在 2 1例 ( 95 5% )HCC中的表达平均升高至NL的 3 45倍 ;在 2 0例 ( 90 9% )HCC中的表达平均升高至PNL的 2 75倍 .以cRNA为内参照的mRNA定量RT PCR结果显示 ,hsp90αmRNA在1 8例 ( 81 8% )PNL中的表达平均升高至NL的 3 0 6倍 ;在全部 2 2例HCC中的表达平均升高至至PNL的 2 0 8倍和NL的 5 1 0倍 .hsp90 βmRNA仅在小部分 ( 8例 ,36 4% )PNL中的表达轻度升高至NL的 1 2 7倍 ,而在全部 2 2例HCC中的表达显著升高至PNL的 2 95倍和NL的 2 52倍 .hsp90α和hsp90 β可能分别在人HCC发生、发展的不同阶段发挥不同的作用 ;以cRNA为内参照的定量RT PCR法是较狭缝杂交法更为灵敏、准确和快捷的mRNA定量分析方法 .

肝癌中高表达的新基因LAPTM4B对细胞增殖及成瘤性的影响

目的 :研究在肝细胞癌中高表达的新基因LAPTM4B对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响 ,探讨LAPTM4B基因的生物学功能。方法 :构建真核表达质粒 pcDNA3 TM 4B ,利用脂质体稳定转染LAPTM 4BcDNA至NIH3T3细胞中 ,用RT -PCR、Northern和Western杂交法筛选和鉴定转染后LAPTM4B基因高表达的单克隆细胞株 ,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果 :与转染空载体的对照组相比 ,转染了LAPTM4BcDNA的NIH3T3细胞表面发生明显变化 ,微绒毛的数量和长度增加 ,多分枝且缠绕成团。转染细胞在纤黏连蛋白、人工基膜和层黏连蛋白基质上的黏附 /铺展能力增强。生长曲线显示转染细胞的生长速率增高。流式细胞仪检测显示转染细胞的S期细胞数比未转染细胞显著增多 ,而G0 ～G1期细胞数减少。Western杂交显示CyclinE蛋白在转染细胞中的表达显著增加。转染细胞对血清的依赖性下降并具有成瘤性。结论 :LAPTM 4B基因能影响细胞增殖的调节 ,促进NIH3T3细胞的增殖 ,并使NIH3T3细胞具有成瘤性 ,在肿瘤发生过程中具有重要的作用。

LAPTM4B基因多态性与肺癌易感性的关系

目的:探讨溶酶体相关4次跨膜蛋白质β(lysosome-associated protein transmembrane4 beta,LAPTM4B)基因多态性与肺癌易感性的关系.方法:以病例-对照研究的方法,用基于特异性引物的PCR对134例正常人和162例肺癌患者进行LAPTM4B基因分型,将卡方检验用于检测肺癌组和对照组基因型频率和其它参数的分布.结果:LAPTM4B的*2等位基因频率在肺癌组中为40.1%,较对照组(28.0%)显著增高(P=0.002).基因型分布在肺癌组和对照组间差异有统计学意义.*1/2和*2/2基因携带者患肺癌的危险性分别是*1/1的1.91倍(95%CI:1.178～3.110)与3.26倍(95%CI:1.338～7.929).LAPTM4B基因型分布与患者年龄,肺癌的病理类型,分化程度,临床分期以及HBV感染等无明显关系.结论:LAPTM4B基因多态性与肺癌易感性相关,* 2等位基因可能是肺癌发生的危险因素.

用荧光差异显示法分离新的肝细胞癌相关基因

目的 :寻找新的肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)相关基因。方法 :应用荧光 差异显示 (fluorescentdifferentialdisplay)技术分析人HCC、配对非癌肝、胎肝、正常肝等组织之间的基因差异表达 ,差异表达cDNA片段 ,经测序后 ,再用RNA狭缝杂交对部分差异片段在上述 4种组织中的表达进行验证。结果 :共得到差异表达cDNA片段 110条。经狭缝杂交筛选 ,获得了 4条阳性片段 ,未知cDNA片段L2和与人醛缩酶B 99.5 %同源的cDNA片段L7在部分HCC中特异性低表达 ,未知cDNA片段LC2 7和与人Nip3基因 99.4%同源的cDNA片段LC2 0在部分HCC中特异性高表达。结论 :确认了 4条HCC相关基因。其中L2和人醛缩酶B基因可能为阻抑HCC发生、发展的基因 ,而人Nip3基因和LC2 7可能为促进HCC发生、发展的基因。L2和LC2 7为目前未知的新基因。

转化生长因子－β对细胞外基质基因表达调节作用的研究进展

转化生长因子－β（ＴＧＦ－β）是一类具有激素样活性的多肽生长因子，许多正常和转化细胞均可合成并分泌ＴＧＦ－β，ＴＧＦ－β既可刺激细胞的增殖，又可刺激细胞的分化，对细胞进行双向调节。细胞外基质（ＥＣＭ）对细胞的增殖和分化也具有控制作用，ＥＣＭ主要成份的ｍＲＮＡ表达可被ＴＧＦ－β诱导和调节，而且两者具有一定的相关性。提示ＴＧＦ－β可能是通过ＥＣＭ实现其对细胞的双向调节。

NDRG1基因与肝组织分化及癌变的相关性

目的 :通过检测NDRG1基因在各种组织和细胞中的表达谱 ,探讨NDRG1与肝细胞分化及肝癌发生、发展的相关性。方法 :通过Northernblot和RT PCR方法检验NDRG1在肝癌和配对的非癌肝组织、正常肝、不同发育时期小鼠肝和人胎肝组织、人胚胎各组织以及多种细胞系中的表达谱。结果 :NDRG1在肝癌组织中的表达量显著高于配对的非癌肝组织和正常肝组织中的表达量 ;而正常肝组织与非癌肝组织相比 ,表达量差异无显著性。在所研究的 10种细胞系中 ,NDRG1的表达量在 2 93T人肾细胞系中最高 ,永生化人肝细胞系L0 2次之 ,在未分化的HLE肝癌细胞系及低分化的肝母细胞瘤HepG2中最低。NDRG1的表达量随婴鼠肝和人胎肝的发育而增高 ,至已达分化的成年肝又有所降低。结论 :NDRG1可能与肝细胞的分化相关 ,并在分化的一定阶段高表达 ,但不宜作为分化的标志物。NDRG1在肝癌中的高表达提示肝癌的形成不单是一种简单的去分化 ,其增殖。

肿瘤细胞粘附、迁移与转移的相关性

肿瘤细胞的粘附、迁移能力与癌转移密切相关．细胞粘附分子选择素、整合素、免疫球蛋白超家族及钙粘素介导同型或异型细胞间以及细胞与基质间的粘附，其在肿瘤细胞表面表达数量或分布方式的改变直接或间接影响着转移潜能，是肿瘤细胞从原发瘤脱落以及着床的关键性环节．肿瘤细胞的迁移能力被认为是癌转移的限速环节．一般情况下，肿瘤细胞在体内或体外的迁移能力与其转移潜能呈正相关性，肿瘤细胞通过对迁移刺激物的趋化性及趋触性应答而完成向远离器官的转移。

LHScDNA的部分克隆及其表达对肝癌细胞行为的影响

目的 :克隆在肝癌组织中低表达的差异显示片段L2的基因cDNA序列 ,并初步探讨其在肝癌发生、发展过程中的作用。方法 :将L2在GenBank中拼接后 ,分析其序列结构 ,并构建正义真核表达质粒 ,转染BEL 740 2肝癌细胞后 ,对转染细胞增殖、粘附、迁移和侵袭等指标进行测定。结果 :克隆得到一条 10 0 5bp的cDNA ,其 5′端 712bp与人Liprinβ1cDNA 5′端调控序列和外显子 1,2 ,3序列同源 (10 0 % ) ,而 3′端 2 93bp与Liprinβ1基因内含子 4同源 (10 0 % )。其间有一个 5 10bp开放阅读框架 ,起始密码位置与Liprinβ1基因相同 ,推断的蛋白产物除C端 13个氨基酸残基外 ,其余均与Liprinβ1同源。此cDNA暂命名为LHS (Liprinβ1 homologoussequence)。LHScDNA正义转染BEL 740 2肝癌细胞系 ,对于细胞的增殖活性和侵袭能力无明显影响 ,但可降低肝癌细胞在层粘连蛋白上的粘附和迁移能力。结论

人肝细胞癌相关新基因的筛选

目的 :寻找肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)相关的新基因 ,并从分子水平进一步探讨HCC发生发展的机制。方法 :对通过荧光 差异显示 (fluorescent differentialdisplay ,FluoroDD)技术从人HCC组织、配对非癌肝 ( pairednon cancerousliver,PNL)组织、胎肝 (fetalliver ,FL)组织和正常肝 (normalliver ,NL)组织获得的 110条差异表达cDNA片段 (DD片段 )中的 2 5条进行测序 ,将测序结果在GenBankNR数据库中进行同源性分析 ,并对其中 12条DD片段用RNA狭缝杂交法验证其在HCC、PNL及NL组织中的表达规律。结果 :2 5条DD片段中 18条与已知基因具有高同源性 ( >96 % ) ;5条与已知序列 (基因结构与功能未知 )具有高同源性 ( >85 % ) ;2条与Gen BankNR数据库中的序列无明显同源性。RNA狭缝杂交筛选到 5条在HCC中特异性高或低表达并与已知哺乳类动物基因高度同源 ( 97%～ 99% )的cDNA片段 :在HCC中特异性高表达的 3条片段是LC13(人热休克蛋白 90 β)、LC2 1(智人异源性核内核糖核蛋白C)和LC2 2 (干扰素诱导的智人鸟嘌呤结合蛋白 2 ) ;在HCC中特异性低表达的 2条片段是LC5 (智人甲状腺激素受体相关蛋白 2 40 )和FL2 5 (分化相关基因 1)。结论 :新发现 5条与HCC相关、与已知哺乳动物基因高度同源的cDNA片段。

层粘连蛋白受体及其在肿瘤转移中的作用

本文重点介绍近几年来国内外有关层粘连蛋白受体的研究进展:层粘连蛋白受体的分离纯化及理化性质;它在正常细胞中的功能,尤其是在癌转移中的作用。

LAPTM4B新基因在肿瘤细胞中的表达及其免疫学检测技术的建立

目的利用制备的鼠抗人肝癌相关LAPTM4B蛋白的单克隆抗体,检测LAPTM4B蛋白在不同肿瘤细胞中的表达。方法重组质粒pGEX-KG-LAPTM4B-N1-99经酶切及测序鉴定正确后,1 mmol/L IPTG 37℃诱导获得融合蛋白。利用亲和层析方法纯化抗人LAPTM4B单抗,免疫印迹法进行单抗鉴定,免疫细胞化学染色法检测5种肿瘤细胞中LAPTM4B的表达。结果经western b lot分析抗LAPTM4B单抗可与LAPTM4B-N1-99编码的融合蛋白以及肿瘤细胞中的天然蛋白特异性结合。免疫细胞化学染色(IHC)检测到肝癌、肺癌等5种肿瘤细胞均表达LAPTM4B蛋白。IHC和免疫印迹分析证明了LAPTM4B蛋白在肿瘤细胞中的表达。结论该单抗能特异识别原核及真核细胞表达的LAPTM4B蛋白,为进一步探讨LAPTM4B蛋白的生物学效应提供了条件。

层粘连蛋白总糖肽抗癌细胞转移机制的研究

从癌细胞增殖、凋亡和基质金属蛋白酶 (matrixmetalloproteinases,MMPs)的分泌等方面研究层粘连蛋白总糖肽 (laminin glycopeptides,LN GPs)抗癌细胞转移的机制。 方法 :将人肝癌细胞系Bel740 2细胞于层粘连蛋白基质上孵育一定时间后 ,噻唑蓝比色法测活细胞群体总数。3H TdR参入法测癌细胞DNA的合成 ;荧光素活化的细胞分拣术 (fluorescentactivatedcellsorting ,FACS)测定细胞周期 ;细胞经吉姆萨染色后计数有丝分裂指数 ;FACS和丫啶橙染色法检测细胞的凋亡。明胶酶谱分析法检测无血清培养上清中癌细胞分泌MMPs的水平。糖肽组加LN GPs (5 0mg·L-1)。结果 :癌细胞孵育后 ,活细胞群体总数增加 ,3H TdR的参入升高 ,G1期细胞减少而S期细胞增加。相反 ,加LN GPs组活细胞群体总数明显降低 ,3H TdR的参入下降 ,G1期细胞增加而S期细胞减少 ,与未包被组结果相近。但两种方法均未检测到明显的癌细胞凋亡。LN GPs组人肝癌细胞系Bel740 2细胞和高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG细胞的MMPs分泌和活化明显降低。结论 :LN可促进癌细胞的增殖 ,而LN GPs能抑制这一作用 ,并可明显抑制癌细胞MMPs的分泌 ,这可能是其抑制癌细胞侵袭和转移的重要环节。

LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的:LAPTM4B基因是肝癌中高度表达的新基因。为下一步LAPTM4B启动子的活性分性,本文构建了LAPTM4B基因启动子调控的报告基因重组表达质粒。方法:以LAPTM4B基因组cDNA为模板扩增翻译起始位点上游DNA序列。PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,并经限制性内切酶消化鉴定。结果:通过酶切鉴定和基因测序,证明成功地构建了三种不同长度的pGL3-LAPTM4B-Luc荧光素酶表达质粒,形成了系列的LAPTM4B启动子重组体。结论:充分利用生物信息学资源,利用已知基因的启动子序列,可快速,准确地克隆已知基因启动子序列并构建启动子载体。LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建为LAPTM4B启动子的活性分析奠定了基础。

层粘连蛋白特异性受体——整合素α6亚单位胞外区单克隆抗体的制备及鉴定

目的 :制备针对整合素α6胞外区的单克隆抗体并鉴定其生物学特异性。方法 :利用整合素α6cDNA构建可表达整合素α6胞外区的原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达GST———整合素α6胞外区融合蛋白。融合蛋白经凝胶分离纯化后免疫Balb C小鼠 ,取其脾细胞 ,用传统杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合及次黄嘌呤、氨基喋呤与胸苷选择性培养。单克隆杂交瘤上清经ELISA双筛后 ,分析其亚类及进行免疫细胞化学鉴定。结果 :经ELISA双筛 ,获得了一株能稳定分泌针对整合素α6胞外区的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,其分泌抗体亚类为IgG1。免疫细胞化学显示此单抗在人肝癌细胞系BEL 74 0 2呈强阳性反应。结论 :通过原核表达产物制备并纯化了针对整合素α6胞外区的单克隆抗体 ,对分离纯化α6亚单位、研究其生物学作用及鉴定正常和疾病状态下是否表达整合素α6及其水平具有重要意义。

糖肽对小鼠Lewis肺癌实验性转移作用的初步病理观察

我们曾报道从小鼠Lewis肺癌组织通过蛋白水解酶及分子筛层析分离的总糖肽,在体外可明显地抑制某些肿瘤细胞及分离的层粘连蛋受体与基膜成分层粘连蛋白的识别和结合。本文报告将此糖肽与Lewis肺癌细胞混合,通过尾静脉注入小鼠体内,对实验性癌转移的抑制作用。初步病理结果表明,此糖肽几乎可以完全抑制实验性转移瘤的形成,保护小鼠不死于癌转移。提示糖肽可能具有阻断癌转移之作用。将实验组一部分存活小鼠再行同种癌细胞皮下接种,可以照常成瘤。表明糖肽阻抑实验性癌转移的效能可能并非调动了宿主的免疫机制所致。糖肽还可减慢皮下接种的癌细胞的生长速度,但对癌细胞并无直接毒性作用。