半理性设计提高甲酸脱氢酶(Cb FDH)活力及热稳定性

甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)是NADH循环再生的最佳酶之一,广泛应用于食品、医药和化工等行业。但是野生型甲酸脱氢酶普遍存在酶活低、催化效率差等缺点,导致产品转化率较低,影响产品的工业化生产。为了获得具有更佳催化性能的甲酸脱氢酶,作者以博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)来源的甲酸脱氢酶为模板,利用HOTSPOT WIZARD v3.1进行三维结构模拟预测,构建了P68G、Q197K两个突变体,比酶活较野生型分别提高了11%和33%。这是由于P68G氨基酸残基侧链的苯环被氢取代,减少了甲酸盐底物进入口袋的空间位阻;而Q197K侧链酰胺基突变为胺丁基增强了酶的柔性。然而这两个突变点对甲酸脱氢酶的热稳定性产生了负面影响,因此在I239位引入半胱氨酸突变与C262构成二硫键以提高其热稳定性,最终获得一株热稳定性显著提高,比酶活较野生型提高31%、较I239C提高45%的突变株Cb FDH Q197K/I239C。通过半理性预测蛋白质结构提高了甲酸脱氢酶的活力和热稳定性,为高效构建性能稳定、还原力强的甲酸脱氢酶提供了理论基础。

新型一氧化氮比率型纳米探针的构建及性能研究

该文首先通过两步化学反应合成NO识别分子3,4-二氨基苯硫醇(DABT),然后制备具有强表面拉曼增强散射(SERS)效应的银包金纳米星(AuNSs@Ag)材料,并通过Ag—S键对其进行DABT修饰,制备了比率型SERS纳米探针AuNSs@Ag-DABT。利用透射电子显微镜、水合粒径、Zeta电位以及紫外吸收光谱对纳米探针进行表征,并开展了NO的定量检测。结果表明:构建的AuNSs@Ag-DABT纳米探针表面有尖锐突出的星状结构,尺寸约为80 nm。NO存在时,DABT与NO发生反应并在541 cm^(-1)附近出现一个新的拉曼峰(三唑环),而在1078 cm^(-1)处的拉曼峰(C—S离面弯曲峰)强度保持不变,因此可以根据I_(541)/I_(1078)的比值定量检测NO。在最优条件下,I541/I1078的比值与NO浓度在10~60 nmol/L范围内表现出良好的线性响应,检出限为3.89 nmol/L。选择性实验表明该比率型SERS纳米探针对NO响应具有良好的专一性和抗干扰性。

从酵母中提取谷胱甘肽的初步研究

考察了不同提取方法对从酵母中提取谷胱甘肽（GSH）的影响，热水抽提由于其提取收率高（90％）、耗时短（10min）、经济性强而明显优于其它提取方法。对732阳离子交换树脂纯化GSH进行了初步研究，主要研究了树脂颗粒大小对提纯GSH的影响。采用60～80目的树脂，GSH收率为576％，虽然比80目以上的树脂低10％，但前者操作所需时间只有后者的1／3。

谷氨酰胺转胺酶的功能性质及其在食品中的应用方法

本文主要论述了微生物谷氨酰胺转胺酶的性质、功能及其在食品加工工业以及开发新型食品中的应用。

微生物转谷氨酰胺酶的纯化方法和酶学性质研究

由Streptoverticilliummobaraense发酵生产的转谷氨酰胺酶经过除菌体、超滤浓缩、乙醇沉淀、干燥后得到粗酶产品 ,其活力回收率约 70 %。又经Superdex 75凝胶过滤和Source 30S阳离子交换两步纯化后得到纯酶 ,最终酶活力收率约 37%。酶最适温度为 5 0℃ ,在 4 0℃以下稳定性良好 ;最适 pH为 6 .0 ,pH4 .0～ 8.0时比较稳定。离子强度对酶影响很小。

《生物分离原理与技术》卓越课程建设的探索

《生物分离原理与技术》是生物技术、生物工程及相关专业的主干课程,课程内容理论联系实际,既需要学生掌握各项技术的基本原理,又需要学生能针对实际遇到的分离问题,合理组合并熟练使用这些技术,以达到课程教学的真正目的。为此,本课程创新发展了多个教学和评价环节,经过初步实践,取得了良好的教学效果,证明该教学实践模式具有一定的推广应用价值。

钙离子对HRPC结构和电催化活性影响的研究

通过比较辣根过氧化物酶同工酶C(HRPC)中Ca2+移除前后的HRPC的光谱和电化学特性,阐明了Ca2+的存在对HRPC的重要作用。移除Ca2+后HRPC的紫外-可见吸收光谱发生了变化,Soret带的最大特征吸收峰以及α带和β带特征吸收峰均发生不同程度的蓝移和峰强减弱,表明其血红素微环境及结构发生了变化。移除Ca2+后的HRPC也可在与聚L型赖氨酸共修饰的石墨电极上表现出对H2O2的催化响应,但是天然HRPC比去除Ca2+后的HRPC对H2O2表现出更低的检测限,更宽的检测范围,更高的灵敏度以及更好的稳定性。实验结果表明,Ca2+对HRPC血红素微环境的保持、催化活性和稳定性均有重要的作用。

乙醇对肌红蛋白电化学行为的影响及其在生物传感器研制中的应用

该文首先研究了乙醇对肌红蛋白直接电化学及电催化活性的影响。结果表明,实验所用缓冲体系中乙醇的存在可以促进肌红蛋白在电极上的电子传递以及结合及催化O2的能力。紫外吸收光谱显示,乙醇体积分数不超过20%时将不会改变该蛋白质的结构。进一步研究表明,乙醇体积分数为0～20%时,肌红蛋白对H2O2的催化峰电流随实验所用缓冲体系中乙醇体积分数的增加而增大,表明少量乙醇的存在可以增强肌红蛋白对H2O2的电催化响应。在此基础上,构建了更加灵敏的H2O2生物传感器,其响应的线性范围为5.0×10-6～6.0×10-4mol/L,灵敏度为48.7μA/(mmol/L)。

环境条件及摇瓶补糖策略对谷胱甘肽发酵的影响

研究了酵母摇瓶发酵中ｐＨ、装液量、初糖浓度、碳氮磷比和补糖方式对谷胱甘肽（ＧＳＨ）发酵的影响。结果表明，ＧＳＨ发酵适宜的初始ｐＨ和装液量分别为６０和５００ｍｌ锥形瓶内装液量６０ｍｌ。初糖浓度对ＧＳＨ发酵有较大的影响，超过１２ｇ／Ｌ的初糖浓度将减少胞内ＧＳＨ含量。应用计算得出的一种以控制比生长速率为目的的摇瓶补糖策略，在总糖浓度为２６２ｇ／Ｌ下发酵１２ｈ，最终细胞浓度和胞内ＧＳＨ含量分别达到８７８ｇ／Ｌ和１３６ｍｇ／ｇ，发酵液内ＧＳＨ总量达到１１９４ｍｇ／Ｌ，细胞对糖产率达到０３３５ｇ／ｇ。

氨基酸和酵母膏对谷胱甘肽发酵的影响

研究了氨基酸和酵母膏对酵母发酵生产谷胱甘肽（ＧＳＨ）的影响。结果表明，多种氨基酸能促进酵母的生长，对ＧＳＨ的生物合成却没有明显促进作用，而半胱氨酸则表现为在抑制酵母生长的同时显著提高胞内ＧＳＨ含量。半胱氨酸初始浓度为５ｍｍｏｌ／Ｌ时ＧＳＨ比产生速率最大，为３．７ｍｇ·ｇｃｅｌ－１·ｈ－１。酵母膏对酵母的生长和ＧＳＨ的合成均有显著的促进作用。若不添加酵母膏，则３％糖浓度下胞内ＧＳＨ含量只有１％糖浓度下的５０％；而若在３％和１％糖浓度下分别添加０．６％的酵母膏，前者胞内ＧＳＨ含量比不加酵母膏的对照提高了一倍左右；３％糖浓度（补糖操作）发酵液中ＧＳＨ总量（９２．５ｍｇ／Ｌ）比１％糖浓度的ＧＳＨ总量高４８％。

芥子酸及其衍生物对酪氨酸酶抑制作用的电化学研究

采用电化学方法研究了芥子酸、芥子酸甲酯及芥子碱对酪氨酸酶的抑制作用．结果发现，酪氨酸酶电极对其底物邻苯二酚有良好的电催化作用，电流响应在底物1．0×10^-7～6．0×10^-5moL／L的浓度范围内呈线性关系，并具有较高的灵敏度（60．93nA·L／μmol）；芥子酸及其衍生物都对酪氨酸酶的活性有抑制作用，抑制能力大小的顺序为芥子酸〉芥子酸甲酯〉芥子碱．通过对这3种物质的抑制参数的计算结果表明，芥子碱是非竞争型抑制，而芥子酸和芥子酸甲酯是混合型抑制．这3种物质对酪氨酸酶可能的抑制机理一是抑制物与底物竞争酶的双铜活性中心；二是抑制物具有抗氧化活性，因而抑制酶对底物的催化反应．

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质

茂原链轮丝菌Streptoverticilliummobaraense所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液通过抽滤、超滤、乙醇沉淀、离心和冷冻干燥,制得粗酶粉的酶活约为1033U/g.对粗酶研究发现,该酶的最适反应温度为52℃,最适pH为6.0;粗酶的pH稳定范围在4～8,温度稳定范围在20～40℃,离子强度对该酶的活性稍有影响.粗酶经CM 纤维素层析和SephadexG 75凝胶过滤层析后得到较纯的酶,通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白质纯度,得到较弱的单一区带.其中,CM 纤维素层析的纯化倍数为4.5,收率质量分数约为78.8%;凝胶过滤层析纯化倍数为1.11,收率质量分数为50%;用凝胶过滤法测得谷氨酰胺转胺酶的相对分子质量为40092.

条斑紫菜蛋白酶解产物中抗菌肽的纯化及特征

以酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌能力为指标,筛选出木瓜蛋白酶并优化确定酶解条件,酶解液中分子量在1000 Da以下的小分子肽类占96.68%;采用DEAE-52纤维素阴离子交换层析、Sephadex G-25凝胶层析得到纯化的紫菜蛋白抗菌肽(LPAP);液质联用分析该纯化抗菌肽中主要的多肽序列为FFDD(Phe-Phe-AspAsp);该LPAP对G+菌和G-菌都有抑制作用,具有相对广谱性,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)为0.25 mg/m L,抗菌肽作用金黄色葡萄球菌的电镜照片表明其抑菌机制可能是对细胞膜的破坏作用。

条斑紫菜蛋白酶解产物中α-葡萄糖苷酶抑制剂纯化及特性

以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标,优选出1398中性蛋白酶、碱性蛋白酶和氨肽酶在一定条件下复配酶解条斑紫菜蛋白制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。酶解液加入乙醇至终浓度为60%以沉淀去除多糖,上清液为α-葡萄糖苷酶抑制剂粗品。该粗品利用SP Sepharose High Performance阳离子交换层析、Sephadex G-10凝胶层析和Mono Q阴离子交换层析进行分离纯化,获得一种肽类α-葡萄糖苷酶抑制剂(LGI)。LGI经反向高效液相层析测定纯度为62.4%,基本特性分析显示其具较好的温度和pH稳定性,对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50值为97.36μg/mL,属于一种非竞争性抑制剂。

基于生物条形码探针和金纳米颗粒的大肠杆菌O157：H7检测

建立一种基于生物条形码探针和金纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)对致病性大肠杆菌O157:H7检测的新方法。用生物功能化的磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)和AuNPs与目标物大肠杆菌O157:H7进行免疫反应,形成MNPs/目标物/AuNPs"三明治"式复合体。利用去杂交将AuNPs上标记的条形码DNA释放出来,通过DNA探针杂交条形码DNA引起AuNPs颜色变化来确定大肠杆菌O157:H7的存在,这种颜色变化很容易用裸眼观察到并且可以通过紫外-可见吸收光谱定量分析,该方法在纯样品和牛奶中最低检测限为102CFU/mL,检测范围为102～106CFU/mL。应用基于生物条形码探针和AuNPs对大肠杆菌O157:H7检测具有准确、快速、操作简单的优点,为食品安全监测提供了新的方法。

超声振荡改性玉米醇溶蛋白及高F值寡肽制备

玉米醇溶蛋白经225 W的超声振荡处理90 min,改善其结构特性,解决50℃加热会形成“粘弹性面筋团”的现象。通过扫描电镜、红外光谱、差示扫描量热技术,清晰看到其微观表面形貌由片型韧状转变为块型松散状,变性峰显著减小,酰胺Ι带(1700~1600 cm-1)的吸收强度明显减弱。松散蛋白经Alcalase 2.4L碱性蛋白酶水解及超滤、纳滤膜过滤,得到F值为4.07的粗肽,其中相对分子质量小于1000的占比97.62%。ɑ-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A依次定向水解粗肽,联合活性炭脱芳,制备F值高达41.87的玉米寡肽,其中苯丙氨酸和酪氨酸仅占总氨基酸的0.73%,相对分子质量180~1000的占比71.37%。

结合学科发展 注重新型生命科学人才的培养

生命科学是一个在多学科交叉和互动中发展着的动态的科学创新体系,其基础研究和应用研究的结合越来越紧密。本文从生命科学发展的这两个特点出发,阐述了培养新型生命科学人才的思路。

浅谈生物化学实验教学在高校生物化学教学中的作用

生物化学实验教学是高校生物化学教学的重要组成部分,对于加深学生对生物化学专业理论知识的理解和掌握,培养学生对生命科学的科研兴趣和求知欲,以及锻炼学生的实践能力和分析问题、解决问题能力都具有重要的作用,本文就此阐述了几点体会。

探讨磁化对α—淀粉酶活性及其稳定性的影响

在不同温度不同时间下探讨磁化对α—淀粉酶活性的影响 ,发现磁化 30min能使α—淀粉酶的活性提高 10 %左右 ,在 4 0℃、5 0℃、6 0℃下分别磁化一定时间 ,分析磁化酶与天然酶的相对残余酶活 ,证实磁化对α—淀粉酶确有激活作用 ,且能提高α—淀粉酶活的热稳定性。

重组大肠杆菌生产人血管抑素的发酵条件

对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达量达到560mg/L.