天花粉蛋白诱导黑色素瘤凋亡机制的研究

目的:研究天花粉蛋白(TCS)对黑色素瘤B-16细胞的作用,探讨天花粉蛋白抗肿瘤的机制。方法:(1)应用单细胞电泳及Hoechst33258染核形态观察来研究TCS对黑色素瘤B-16细胞损伤作用。(2)应用激光共聚焦扫描显微术结合特异性荧光探针Fluo-3/AM、H2DCF-DA和DAF-FM diacetate观察在TCS作用下,单个瘤细胞内钙离子(Ca2+)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的信号动态变化,并探讨细胞内ROS和NO的增加与钙离子的关系。结果:(1)终浓度50mg/L TCS孵育3h、6h后,单细胞电泳、Hoechst33258染色的核形态观察未发现与对照组有明显区别;孵育12h后单细胞电泳可见DNA损伤的特征性现象-彗星尾巴;Hoechst33258染色的核形态观察发现有明显的核浓缩和边集现象,出现特征性凋亡小体。(2)终浓度50mg/L的TCS可引起细胞内Ca2+、NO和ROS的生成量明显高于对照组(P<0.01)。细胞内ROS和NO的增加与钙离子的增加密切相关。结论:天花粉蛋白对黑色素瘤B-16细胞DNA具有较强损伤作用,可诱导其发生凋亡;天花粉蛋白诱导凋亡可能与细胞内钙、ROS和NO的增加有关。

异硫氰酸荧光素标记动态观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞的损伤

目的:应用异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白,在激光共聚焦显微镜下直接观察天花粉蛋白进入黑色素瘤B16细胞的动态过程并分析其对黑色瘤B16细胞的损伤作用。方法:实验于2003-08/2004-08在南通大学神经再生重点实验室完成。将常规传代培养的黑色素瘤B16细胞用胰酶消化,以5×109个/L的浓度种植于24孔培养板。将天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白分别加入培养细胞中,终浓度为50mg/L,同时加入等量生理盐水作为正常对照组,每组再分别设3,6,12h不同孵育时间组。异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白后,利用激光共聚焦显微镜观察异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白进入细胞的过程及其荧光强度,CCK-8细胞毒性实验评估各组细胞存活率、并用单细胞凝胶电泳及hoechst33258染核观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞致DNA损伤作用。结果:①终浓度50mg/L的异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白孵育3h时已经进入黑色素瘤细胞,6h时进入细胞量达到最高,12h时已轻度下降,各时间点比较差异有统计学意义(P<0.01)。异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白组与异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白组荧光强度差异有显著性(P<0.01)。②终浓度50mg/L异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、天花粉蛋白孵育黑色素瘤细胞3,6h后利用单细胞电泳和Hoechst33258染色未观察到核形态的变化;但孵育6h后CCK-8细胞毒性实验显示活细胞数量明显下降;孵育12h后出现DNA损伤的特征性彗星尾现象,并观察到明显的核浓缩和边集现象,出现特征性凋亡小体。结论:孵育6h时天花粉蛋白进入细胞量最多,但并没有明显的细胞DNA损伤的作用,而孵育12h时产生明显的细胞毒作用和凋亡的发生。

HSPgp96诱导巨噬细胞呼吸爆发与细胞内外游离钙关系的研究

目的:探讨从小鼠H22肝癌细胞中提纯的热休克蛋白gp96(HSPgp96)对小鼠腹腔巨噬细胞(PEMφ)呼吸爆发的影响及其与细胞内外游离钙的关系。方法:(1)用亲和层析和离子交换层析等方法从小鼠H22肝癌细胞中获得纯化的HSPgp96。(2)用细胞内过氧化物荧光探针H2DCF-DA监测HSPgp96作用于小鼠PEMφ过程中,单个细胞活性氧(ROS)信号的变化,反映PEMφ内呼吸爆发时的变化过程;用荧光探针Fluo-3/AM监测HSPgp96作用于小鼠PEMφ过程中,单个细胞内钙离子([Ca2+]i)信号的变化。(3)使用细胞膜和细胞内钙通道抑制剂及钙离子载体后,再观察HSPgp96作用后ROS信号的变化。结果:(1)加入HSPgp96后PEMφ内Fluo-3荧光强度立即上升,70s时增幅达161.05%±50.99%;当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后110s增幅分别为84.81%±29.52%和46.21%±17.24%。同时阻断胞内外钙作用,HSPgp96这一诱发功能明显被抑制。加入钙离子载体后可见细胞内荧光强度迅速增强,于110 s时达156.98%±45.83%,随后迅速下降。(2)小鼠PEMφ受HSPgp96刺激后表征ROS的荧光强度立即上升,620 s达基础荧光值的636.78%±82.02%,随后始终维持在高水平。当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后,再加入HSPgp96后细胞内ROS荧光值上升幅度较小。同时阻断了胞内外钙作用后,HSPgp96刺激后ROS荧光值上升没有明显高峰出现。结论:HSPgp96作用于小鼠PEMφ后,促进了细胞外钙内流并使细胞内钙库释钙,这是HSPgp96诱发细胞内活性氧增加的基本机制。

天花粉蛋白诱导H_(22)肝癌细胞凋亡的研究

目的 :观察天花粉蛋白 (trichosanthin,TCS)在体外诱导 H2 2 肝癌细胞凋亡的效果。方法 :以不同剂量的 TCS加入到H2 2 肝癌细胞溶液中 ,在 2 4孔培养板上培养 72 h后荧光染色并涂片 ,激光共聚焦显微镜下观察 TCS诱导 H2 2 肝癌细胞凋亡的作用效果。结果 :10 μg/ml浓度的 TCS就可诱导 H2 2 肝癌细胞出现典型的凋亡形态学特征。经统计学分析 ,10 0 μg/ml TCS组与 5 0 μg/ml TCS组间差异无统计学意义 (P>0 .0 5 ) ,其余各组间差异均有统计学意义 (P<0 .0 1)。TCS的作用浓度与凋亡指数间有正相关关系 (r=0 .9713,P<0 .0 1)。结论 :TCS在体外可诱导 H2 2 肝癌细胞发生凋亡 ,诱导 H2 2 肝癌细胞凋亡是 TCS抗肝癌作用的机制之一 ,具有成为肝癌治疗新药的潜在价值。

PBL教学模式在神经生物学教学中的应用体会

神经生物学（Neurobiology）是一门在分子、细胞、器官和整体等多个水平上研究神经系统的形态和功能的综合学科。神经生物学是在传统神经科学的基础上成长和发展起来的一门新兴的综合性的边缘学科，涵盖了基础神经科学的诸多学科，内容涉及神经解剖、生理、药理、病理、生物化学和细胞生物学及分子生物学等学科。如何将神经科学基本原理和科研进展以系统、合乎逻辑的方式教给学生，是当今神经生物学教学的一项难题。针对神经生物学的教学特点，我们尝试运用PBL（problembasedlearnin）教学模式来充分调动教师和学生两方面的积极性。收到了较好教学效果。

激光共聚焦镜下观察天花粉蛋白进入瘤细胞的动态过程

目的:观察FITC标记的天花粉蛋白(TCS)进入瘤细胞的过程。方法:通过低温离心、丙酮分级沉淀、等电点沉淀及透析技术由新鲜栝楼根原汁中提取TCS;用FITC标记TCS,在激光共聚焦显微镜下动态观察FITC-TCS进入瘤细胞的过程。结果:纯化的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为单一带,且与标准TCS泳率相同;终浓度50μg/ml FITC-TCS的孵育3h时已经进入黑色素瘤B-16细胞,6h时FITC-TCS进入细胞量达到最高,12h时已轻度下降,组间差异有统计学意义(P<0.01)。FITC-TCS组与对照组(FITC-BSA)荧光强度差异有统计学意义(P<0.01)。结论:采用FITC-TCS,可在激光共聚焦显微镜下观察到进入瘤细胞的动态过程。

热休克蛋白gp96-肽复合物的提取及纯化

目的:建立从H22肝癌细胞中提取、纯化热休克蛋白gp96肽复合物的方法。方法:①制备H22肝癌细胞蛋白:将H22肝癌细胞裂解、离心、过滤及透析后获得。②gp96肽复合物的纯化:上述可溶性H22肝癌细胞蛋白经分级硫酸铵盐析后,依次用ConASepharose亲和层析、SephadexG25更换缓冲液及DEAESephacel离子交换层析分离纯化。③gp96肽复合物的鉴定和浓度测定:所得蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot进行蛋白分子量及性质鉴定,Lowry法测定蛋白浓度。结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染鉴定为单一带,分子量为96kD;Westernblot结果证实为HSPgp96。每20ml压积H22细胞最终获得1mg的HSPgp96。结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度HSPgp96肽复合物。

热休克蛋白gp96对巨噬细胞功能的影响

背景与目的:热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)gp96在抗原递呈和肿瘤特异性免疫治疗中具有重要作用,但其对巨噬细胞的作用机制尚待深入研究。本研究旨在探讨HSPgp96对小鼠腹腔巨噬细胞(peritonealelicitedmacrophages,PEMφ)功能的影响。方法:应用激光扫描共聚焦显微术,结合特异性荧光探针Fluo3-AM、DAF-FM-DA和H2DCF-DA,检测在HSPgp96作用下,腹腔巨噬细胞内钙离子(Ca2+)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的动态变化,并用荧光标记技术检测小鼠腹腔巨噬细胞MHCⅡ及CD86的表达强度和分布的变化。结果:小鼠腹腔巨噬细胞受HSPgp96刺激后,细胞内Ca2+、NO和ROS的生成量都快速升高,分别在刺激后30s、80s和580s时达峰值,增幅分别为(161.06±70.99)%、(77.58±31.17)%和(647.28±185.70)%。小鼠腹腔巨噬细胞受HSPgp96刺激后MHCⅡ阳性表达率:对照组为(40.9±3.5)%,HSPgp96(60mg/L)组为(61.8±5.1)%;CD86阳性表达率:对照组为(23.1±3.1)%,HSPgp96(60mg/L)组为(54.9±2.0)%。结论:HSPgp96在体外可使小鼠腹腔巨噬细胞内Ca2+、NO及ROS生成量明显增加;使抗原递呈分子MHCⅡ、CD86的表达明显上调。

《生物医学电子显微镜技术》课程教学初探

《生物医学电子显微镜技术》主要是在很多医学等高等学校中,特别是在研究生教育中开设的的一门多学科交叉课程。该门课程对于培养高素质的生物医学类人才具有重要意义。为提高学生的学习兴趣,努力取得较好的教学效果,本文结合日常的课堂及实验课教学实践,探索适应现阶段实际情况的本课程教学方法。

用宏程序实现在数控车床上加工锯齿形螺纹

锯齿形螺纹是一种非标准螺纹，通常采用成形车刀在卧式车床上进行加工。2006年第二届全国数控技能大赛中，数控车实操项目要求完成锯齿螺纹的加工，零件简图如图1所示。比赛现场没有提供锯齿形螺纹成形刀，只提供了标准机夹刀具（刀杆型号：DVJNR2020K16，刀片型号：VBMT1604），如图2所示。

HSPgp96与rIL-2治疗小鼠H22肝癌移植瘤的实验研究

目的 :研究热休克蛋白 gp96 (Heat- Shock Protein gp96 ,HSPgp96 ) -肽复合物瘤苗与重组人白介素 -2 (Recombinant Human Interleukin- 2 ,r IL- 2 )对小鼠 H2 2肝癌移植瘤的治疗效果。方法 :从 H2 2肝癌细胞中提取和纯化 HSPgp96。建立小鼠 H2 2肝癌移植瘤模型 ,应用 HSPgp96与 r IL - 2治疗并比较疗效 ,观察指标 :瘤重 ,光镜、电镜下观察组织结构。结果 :经鉴定获得纯化的 HSPgp96。HSPgp96 5 μg与 r IL- 2 2 5 ku治疗小鼠 H2 2肝癌有效。结论 :该实验方法提纯的 HSPgp96与重组人 IL - 2都能有效抑制小鼠 H2

心肌细胞生长激素信号传导与MAPK超家族

生长激素刺激培养新生大鼠心肌细胞，用含ＭＢＰ凝胶分离法测定细胞外信号调节酶（ＥＲＫ）活性。用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｏｔｉｎｇ法检测磷酸化的ｐ３８ＭＡＰＫ，观察心肌细胞内ＭＡＰＫ超家族活性变化，探讨心肌细胞ＧＨ信号传导途径。结果发现：生长激素激活心肌细胞ＥＲＫｓ呈时间和浓度依赖性关系。而对ｐ３８ＭＡＰＫ无磷酸化激活作用。表明心肌生长激素信号传导通过ＭＡＰＫ超家族成员ＥＲＫ途径，而与ｐ３８ＭＡＰＫ途径无关。生长激素诱导的心肌细胞ＥＲＫ激活，可能是生长激素心脏效应的重要机制之一。

热休克蛋白gp96诱导巨噬细胞一氧化氮释放与细胞内外游离钙关系的研究

目的:探讨从小鼠H22肝癌细胞中提纯的热休克蛋白gp96(HSPgp96)对小鼠腹腔巨噬细胞(PEMφ)NO释放的影响及其与细胞内外游离钙的关系。方法:(1)用亲和层析和离子交换层析等方法从小鼠H22肝癌细胞中获得纯化的HSPgp96。(2)用细胞内NO荧光探针DAF-FM-DA监测HSPgp96作用于小鼠PEMφ过程中,单个细胞NO信号的动态变化。(3)使用细胞膜和细胞内钙通道抑制剂及钙离子载体后,再观察HSPgp96作用后PEMφ内NO信号的变化。结果:小鼠PEMφ受Gp96刺激后显示NO的荧光强度立即上升,120 s时达峰值87.58%±18.17%,在830 s时降低接近正常水平。当分别抑制细胞外钙的内流和阻断细胞内钙库释放功能时,NO荧光值高峰明显降低。钙离子载体A23187可迅速诱导PEMφ内NO的合成,120 s时达峰值196.02%±28.68%,随后轻度下降后又逐渐升高,20分钟观察结束时增幅达峰值216.38%±38.39%。如同时阻断胞外钙的内流及胞内钙库释钙功能时,PEMφ受Gp96刺激后NO荧光值高峰几乎消失。结论:Gp96可促使小鼠PEMφ的NO生成快速增加,并与细胞内钙的浓度升高有关。

开发网络教学资源 构筑终身教育体系

本文探讨了网络教学的特点与潜力,以及当前所存在的问题,并通过“数控实验室”网站的实践,初步摸索出一条行之有效的路子和较为满意的运作方式。

骨髓基质细胞对背根神经节细胞生长的影响

目的:体外研究骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells,MSCs)对背根神经节细胞生长的影响。方法:采用差速贴壁的方法分离、培养大鼠骨髓基质细胞。经transwell膜与新生大鼠背根神经节细胞联合培养。利用MTT、细胞免疫荧光组织化学方法检测骨髓基质细胞对背根神经节细胞生长的影响。结果:联合培养后的新生大鼠背根神经节细胞活力增加,神经突起增长。结论:骨髓基质细胞对于背根神经节细胞的活力以及神经突起生长有一定的促进作用。

基于ansys固液耦合的液压阀仿真分析与改进

本文通过系统建模研究了某型号的液压阀在稳态工作情况下的局部稳定性。此型号液压阀在低压低流量的状况下工作时极易出现失稳情况,产生严重的自激振动。在系统模型的基础上,我们通过ANSYS CFX仿真分析改进了原有的阀芯受液动力的公式,以达到更好的准确性。使用改进后的系统模型我们发现通过改变节流孔的面积可显著提高液压阀的稳定性。改进结构后的仿真结果与实际实验数据有相当高的一致性。

机电类专业实践教学体系的开发与实施

实践教学体系主要由实践教学的教学基地、课程体系、课程内容、课程资源、实施方法、教学团队等环节组成,是实践教学活动各构成要素有机联系的总体。常州刘国钧高等职业技术学校机电类专业借鉴国际先进的职教理念,通过多年引企入校、校企深度合作的教学改革,以能力线为核心、课程线为路径、环境线为载体、实施线为手段,系统性地构建了"校企一体、多线整合、学做合一"的实践教学体系、创新了"虚实结合、以实为主"的课程资源开发思路,全面提升学生的综合职业能力和专业人才培养的质量。

COPD患者照顾者姑息照护接受度及影响因素分析

目的调查慢性阻塞性肺疾病患者照顾者姑息照护接受度及影响因素,为实施针对性护理干预提供参考。方法采用一般资料调查表、慢性病患者照顾者姑息照护接受度量表,对125名慢性阻塞性肺疾病患者照顾者进行调查。结果患者照顾者姑息照护接受度总分65.98±11.03;不同文化程度、能否胜任照顾者角色、不同子女数、与家人关系是否融洽的照顾者姑息照护接受度得分比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论慢性阻塞性肺疾病患者照顾者对姑息照护接受度较高,有益于我国姑息照护服务的开展;仍需加强低文化程度、不能胜任照顾者角色、子女数目较多、与家人关系不够融洽的照顾者知识宣教,改善其身心状况,优化患者及照顾者的生活质量。