ω-转氨酶的筛选和异源表达用于制备S-甲氧基异丙胺

根据转氨酶家族进化分类和底物特异性,构建一个包含36个ω-转氨酶的酶库;将酶库中的基因克隆进大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中进行异源重组表达,考察酶蛋白表达水平并测定相应的酶活以及对映体选择性。通过筛选,获得最佳的ω-转氨酶为来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的ω-转氨酶BmeTA,其重组表达粗酶活为2.0 U/mL,纯酶比活为9.5 U/mg蛋白;酶学性质表征发现其最适温度为35℃,最适pH为8.0。在此基础上进一步优化其催化反应工艺条件,在20 g/L加酶量、0.5 mmol/L辅酶添加量以及1.4的氨基供体/氨基受体比例条件下,反应18 h获得450 mmol/L的S-甲氧基异丙胺,原料转化率达到90%,为实现生物催化制备S-甲氧基异丙胺的工业化奠定基础。

尿酸盐在慢性肾病并发肾间质纤维化中的作用及机制

目的探讨尿酸盐在慢性肾病并发肾间质纤维化过程中的作用及机制。方法利用0.2%腺嘌呤的饲料喂养小鼠9周,构建慢性肾病小鼠模型。造模结束后,小鼠眼眶后静脉丛采血,检测肾功能和血尿酸含量;HE染色和PAS染色分析肾脏组织病理变化;Masson染色观察肾脏纤维化程度;尿酸盐染色观察肾组织中尿酸盐沉积;Western blot和免疫组化检测目标分子的表达变化。利用不同浓度尿酸刺激原代培养小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)及人肾小管上皮细胞系(HKC);划痕实验观察尿酸对细胞迁移的影响。结果动物水平上,生化分析检测结果显示,模型组小鼠血清尿素氮(P=0.0064)、肌酐(P=0.0080)、血尿酸(P=0.0007)水平较对照组明显增加;HE和PAS染色结果显示,模型组小鼠出现严重肾小管损伤及炎症细胞浸润;Masson染色结果显示,模型组胶原沉积明显增加;尿酸盐染色结果显示,与对照组比较,模型组小鼠肾组织出现大量尿酸盐结晶;Western blot和免疫组化结果显示,模型组小鼠波形蛋白、平滑肌肌动蛋白和转化生长因子β1(TGF-β1)水平较对照组升高,E钙黏蛋白水平较对照组降低。细胞水平上,划痕结果显示,尿酸刺激促进肾小管上皮细胞迁移;Western blot检测结果与免疫组化一致。结论尿酸可通过促进肾小管上皮细胞分泌TGF-β1,进而促进上皮-间质细胞转分化,加速肾间质纤维化的发生。

LMO4在小鼠胚胎干细胞分化为血管内皮细胞和血管生成中的作用

目的探讨转录因子LIM结构域蛋白4(LMO4)在小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为血管内皮细胞及新生血管中的作用。方法使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从小鼠红系白血病细胞系MEL)中克隆小鼠Lmo4的cDNA,并亚克隆到含有小鼠胎肝激酶-1(Flk-1)启动子驱动表达Gfp的载体(pFG),构建成血管细胞特异性表达的LMO4的载体pFLG。将表达载体转染mESC,通过遗传霉素(G418)筛选,获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株;将这些mESC在体外进行自我分化,以形成4 d和10 d的胚胎体(EB),并进行成血管细胞的集落细胞形成实验(BL-CFC);以10 d-EB进行新生血管出芽实验,观察和分析出芽长短、数目;运用蛋白免疫印迹(Western blot)或定量RT-PCR方法对目的基因的表达进行检测。结果PCR结果证实成功构建了成血管细胞特异性表达的LMO4的表达载体pFLG。通过G418筛选获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株。这些mESC通过自我分化形成4 d-EB和10 d-EB,荧光显微镜下观察到EB内均可见绿色荧光标记的细胞。Western blot检测显示:与mESC相比,4 d-EB和10 d-EB的LMO4的表达显著增加。过量表达LMO4的mESC/pFLG产生BL-CFC效率为(7.70%±1.27%),而mESC/pFG细胞产生BL-CFC效率为(1.15%±0.48%),二者差异有统计学意义(P=0.021)。定量RT-PCR结果显示,Flk-1、C-kit、Tie-2、Ve-cad基因在10 d-EB/pFLG中的表达,均较10 d-EB/pFG中表达增加2倍以上。新生血管出芽实验结果显示,10 d-EB/pFLG的新生血管数量和长度均较10 d-EB/pFG增加(P<0.05)。结论过量表达LMO4促进mESC形成成血管细胞,并有利于血管内皮细胞的分化和血管的新生。

Sigirr缺失调控NF-κB并参与慢性肾病小鼠发生肾间质纤维化

目的研究Sigirr基因缺失小鼠在慢性肾病(CKD)并发肾间质纤维化(RIF)中的作用和机制。方法利用PCR鉴定正常基因型(Sigirr^(+/+))小鼠和Sigirr基因缺失(Sigirr^(-/-))小鼠。含0.2%高腺嘌呤饲料喂养小鼠,连续喂养12周,以建立慢性肾脏损伤并发RIF模型。收集小鼠眼框静脉血以检测肾功能;利用HE染色分析肾脏组织病理变化,通过Masson染色观察肾脏纤维化程度,利用IHC和Western blot检测白细胞介素(IL)-1β、MyD88和NF-κB等信号分子变化,同时观察转化生长因子(TGF)-β1、E-cadherin和Vimentin的表达变化。结果肾功能检测结果显示高腺嘌呤喂养小鼠的血清肌酐和尿素氮较对照组增加;HE和Masson染色结果显示:与Sigirr^(+/+)小鼠比较,Sigirr^(-/-)小鼠的肾组织中,炎症细胞浸润和胶原纤维沉积更明显。IHC和Western blot结果显示IL-1β及其下游的MyD88表达增加,p-P65水平显著增加;Sigirr^(-/-)小鼠的肾组织中IL-1β、MyD88、p-P65等变化较Sigirr^(+/+)小鼠显著;同时TGF-β1显著增加,且Vimentin的表达增加,E-cadherin的表达明显降低,Western blot检测Vimentin、E-cadherin结果与免疫组化一致,且α-SMA也显著升高。结论高腺嘌呤饮食可以建立CKD并发RIF小鼠模型。Sigirr的缺失增加肾间质IL-1β介导NF-κB信号通路的活化,促进TGF-β1表达,有利于上皮-间质细胞转分化相关RIF过程。

基于CRISPR/Cas9系统建立GPR108缺失的THP-1细胞株及其功能初步研究

目的建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法根据人GPR108基因序列设计,合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)对应的DNA,利用分子克隆技术在pL-CRISPR.EFS.GFP慢病毒载体中插入sgRNA1和sgRNA2序列,构建重组载体(pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA1和pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA2)。将测序正确的重组体与包装质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞进行病毒包装,收集病毒液并感染THP-1细胞。利用流式细胞分选技术分离GFP+细胞于96孔培养板中,培养获得单细胞克隆。利用聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测THP-1细胞中GPR108是否敲除成功。应用脂多糖(LPS)刺激GPR108-/-和GPR108+/+的THP-1细胞,Western blot法检测细胞内白细胞介素-8(IL-8)的表达,流式微球技术(CBA)检测细胞培养上清液中的IL-8浓度。结果成功构建重组慢病毒载体pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA,转染THP-1细胞后通过流式细胞仪分选获得单细胞克隆F9。PCR和Western blot法均证实F9是GPR108-/-THP-1单细胞克隆。LPS刺激GPR108-/-和GPR108+/+THP-1细胞,Western blot和CBA的结果均显示敲除GPR108的THP-1细胞中IL-8的合成和分泌明显减少。结论成功建立GPR108缺失的THP-1细胞株;缺失GPR108的THP-1细胞在受到LPS刺激时产生的趋化因子IL-8显著降低。为后续研究GPR108在免疫炎症中的作用奠定了基础。

蛋白酶预处理对玉米蛋白粉中叶黄素提取的影响

选用玉米蛋白粉为原料,通过蛋白酶预处理再进行有机溶剂提取的方式制备叶黄素。与玉米蛋白粉中叶黄素的非酶解直接提取法相比,原料玉米蛋白粉采用最佳蛋白酶水解工艺预处理后(中性蛋白酶,酶用量为14000U/g玉米蛋白粉,液固比为20:1(mL/g),温度40℃,水解时间5h),不但使叶黄素的提取量由非酶解直接提取的165.3μg/g提高到340.5μg/g,而且浸提时间由5h缩短为20min。

过量表达LMO2对成血管细胞增殖和造血分化的作用

目的利用小鼠胚胎干细胞进行体外造血细胞分化,研究LMO2蛋白在成血管细胞分化过程中的作用。方法构建小鼠成血管细胞特异性表达lmo2或绿色荧光蛋白的表达载体,分别转染小鼠胚胎干细胞。经过筛选获得细胞克隆进行自发分化以形成胚胎体。收集分化0～12 d的胚胎体细胞,检测造血细胞相关基因的表达;利用EB细胞进行细胞集落形成实验及血细胞集落形成单位实验,并统计集落形成数。结果成功构建了成血管细胞特异性表达目的基因的表达载体,转染目的基因的小鼠胚胎干细胞在其分化中产生的成血管细胞可特异表达目的基因。过量表达lmo2能够促进造血相关基因的表达,所产生细胞集落数是对照组的2倍,晚期造血分化的血细胞集落形成单位总数是对照组的2.5倍,其中红系集落单位数是对照组的3倍。结论在成血管细胞中过量表达LMO2,促进其细胞增殖及其造血细胞分化。

改良的碱裂解法提取动物细胞附加体DNA

目的利用一种快速、简便的方法提取动物细胞附加体DNA。方法通过电转移的方法介导pEGFP-N1转染小鼠成纤维细胞NIH3T3和中国仓鼠卵巢癌细胞CHO等细胞系。转染后48h,收集转染细胞。用STET缓冲液重悬细胞,加入碱裂解液裂解细胞,再用7.5mol/L醋酸胺中和。离心收集上清,用1∶1酚/氯仿抽提2次,氯仿抽提1次,乙醇沉淀附加体DNA。TE溶解DNA。提取的DNA通过PCR和Southern blot方法进行分析。结果PCR和Southern blot结果证实利用改良的碱裂解法可以从动物细胞提取附加体DNA。结论利用简便快速的碱裂解法可以提取哺乳动物细胞附加体DNA。

波司登四次引领行业变革浪潮

品牌综述：波司登股份有限公司座落于历史文化名城，国际花园城市——江苏常熟，前身可溯源至1976年成立的仅有8台家用缝纫机，11位农民的山泾村村办缝纫组，30年来，波司登以“立民族志气、创世界名牌”为目标，不断追求卓越，现已发展成为国内规模最大、技术最先进，集科研、设计，生产，加工，销售于一体的大型羽绒服装企业，被中国工业经济联合会，中国名牌战略推进委员会推荐为16家“向世界名牌进军，具有国际竞争力的中国企业”之一（纺织服装行业仅此一家），品牌价值逾70亿。

深圳二次改革定方向

8月26日深圳将迎来特区成立的30岁生日。 1980年代创建起来的中国经济特区，已走过30年曲折而辉煌的历程。以深圳为典型的经济特区“摸着石头过河”，成为中国由计划经济向市场经济转型的催化剂，其发展轨迹勾勒出一个改革开放的“中国神话”。

大特区新布局

福田：深圳的“心脏” 从提出建设CBD，到发展总部基地，福田区早已被定义为这座城市的“心脏”。2009年福田区生产总值（GDP）达到1，620亿元，税收总额达430亿元，这两项指标均超越了北京东城区、上海黄浦区等中国一线城市的中心城区。

太原阳曲县：斥巨资改善民生 成效卓著

2009年，在金融危机袭来，传统工业受困之时，地处忻州与晋中盆地之脊梁地带的山西省太原市阳曲县牢牢抓住“民生保障年”重点项目，以事关百姓切身利益的卫生、教育、文化等社会公共事业为出发点，多方筹资，重点建设，真正把钱用在了“刀刃”上，切实让群众受惠，成效卓着。

跨境经济合作升温

2008年以来，始于美国次贷危机的世界金融危机对世界各国经济的发展产生了严重的影响，各国经济增长出现不同程度的下降。中国也不例外，经济增长速度放缓，对外贸易出口严重下降，国外订单大幅度减少，中国经济增长面临严峻的考验。在这样的背景下，跨境经济发展成为新的经济增长点，中国跨境经济合作不断升温。

文博会全面打造国际文化会展名牌 拉动文化产业发展 推动文化产品出口

2004年11月．美丽的滨海之城深圳举办了首届深圳（国际）文化产业博览会。作为中国文化产业领域新秀却又是中国唯一一个国家级、国际性。综合性的大型文化产业展会的文博会．在世人面前的首次亮相便获得了开创性的成功。当年便成为中国文化领域十件大事之一，并引起了海内外极大关注，几年来．文博会由从广东省文化厅，深圳市人民政府等主办升级成为文化部、国家新闻总署，国家广电总局及广东省政府主办，

十载风雨同舟路深港经济融合渐入佳境

在中国改革开放的时代大潮中，香港与深圳以深港经济合作的成功实践，共同谱写了一首崭新的篇章，成为当代中国改革开放和现代化发展进程的突出标志和缩影。在新的历史机遇下与香港开展创新合作，深港共同建设“深港创新圈”，对于保持香港和深圳的繁荣和发展，对于推动国家自主创新战略的实施，建设创新型国家都必将产生积极的意义和重大的影响。

众港谋建世界级大都会——访深圳社会主义学院副院长谭刚博士

无论是经济交往，人员交流乃至生活便利程度等方面，恐怕没有哪个地方像港深这样深入、全面一体化的，很多在深圳上班的香港人和在深圳居住香港上班的香港人每天往返港深之间。以致于香港学者这两年开始热衷于谈论“香港＋深圳”意味着什么：3000平方公里土地，2000万人口的世界级大都市，

第六届文博会圆满落幕

这是新一轮文化产业蓬勃发展时期举行的中国文化产业年度盛会。 为期四天的第六届中国（深圳）国际文化产业博览交易会（简称“文博会”）于5月17日在深圳会展中心圆满落下惟幕。

肾小管上皮-间质细胞转分化模型的建立

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)在人肾小管上皮细胞转分化中的作用,建立肾小管上皮-间质细胞转分化(TEMT)模型。方法实验分为正常对照组和TGF-β1处理组,利用TGF-β1处理人肾小管上皮细胞(HK-2)24 h,分别应用Western blot和免疫荧光方法检测上皮细胞和间质细胞分子标记的表达变化;应用划痕和Transwell assay方法检测细胞迁移及侵袭能力。结果与正常对照组比较,TGF-β1处理组HK-2细胞呈梭形,上皮细胞标记分子E-cadherin表达减弱,差异有统计学意义(P<0.01),间质细胞标记分子骨架蛋白Vimentin和β-catenin表达增强,差异有统计学意义(P<0.01);细胞的迁移及侵袭能力亦明显增强。结论 TGF-β1刺激后HK-2细胞促进上皮细胞转化为间质细胞。

特异性标记胚胎干细胞分化的成血管细胞

克隆小鼠flk1基因启动子和增强子,构建成血管细胞特异性表达GFP载体,并转染小鼠胚胎干细胞(ES)。将ES分化形成胚胎体(EB),观察EB中GFP表达,收集第4天的EB细胞进行流式细胞分析和分选,以获得GFP+细胞进行血细胞集落形成实验,以确定GFP标记细胞造血分化潜能。结果显示,成功构建成血管细胞特异性表达GFP载体;转染的ES形成的EB中可见绿色荧光细胞。流式细胞分析结果发现,转基因组EB中的GFP+细胞(27.5%)与对照组EB中FLK1+细胞(28.1%)比较差异无统计学意义;GFP+和FLK1+细胞形成集落数比较差异无统计学意义。表明对ES分化产生的成血管细胞实现了特异性标记,为后续研究ES体外造血分化的分子机制奠定了基础。

深圳“大特区”浮出水面

日前．在深圳市五届人大一次会议第二场记者会上，深圳市政府新闻办相关负责人正式向媒体公布了国务院对广东省《关于延伸深圳经济特区范围的请示》作出批复的消息。根据批复，从7月1日起，深圳经济特区范围扩大到深圳全市，将宝安、龙岗两区纳入特区范围。扩容后的“大特区”面积将扩大5倍，接近香港面积（1103平方公里）的两倍。