副鸡禽杆菌毒力质粒缺失株的构建及其致病性的研究

为研究副鸡禽杆菌(APG)质粒与菌株致病力的关系,本研究采用42℃诱导的方法缺失APG分离株APG-Hu中的毒力质粒,经PCR鉴定质粒缺失菌株后将其命名为APG-HuΔ。分别采用分光光度计测定OD600nm值法、微量生化鉴定管法、K-B纸片法和雏鸡感染试验测定APG-HuΔ的生长曲线、生化特性、药物敏感性和对雏鸡的致病性。结果显示,在42℃诱导条件下,能够有效缺失APG-Hu中的毒力质粒p250和p A14,而质粒p YMH5未被缺失;APG-HuΔ生化特性、生长曲线及耐药性与APG-Hu相比均无明显差异。雏鸡感染试验结果显示,多数APG-HuΔ感染鸡无明显临床症状,总体发病情况明显弱于同等剂量APG-Hu感染的鸡,表明APG-HuΔ毒力显著降低。本研究结果表明,APG毒力与质粒p250和p A14相关,而质粒p YMH5可能增加APG耐受多种抗生素的风险。本研究为APG致病机理及耐药机制研究奠定基础,也为挖掘APG质粒的应用潜力提供一定参考。

3株鸭疫里氏杆菌的分离鉴定与药敏试验

【目的】了解湖北地区鸭疫里氏杆菌病的分布流行与耐药情况,为该地区肉鸭养殖场鸭疫里氏杆菌病的临床用药提供参考。【方法】对武汉周边区县(江夏区、黄陂区、黄梅县)肉鸭养殖场的鸭疫里氏杆菌疑似病例进行采样并分离病原菌,对分离菌的形态学、染色特性、生化特性、16S rRNA进行鉴定,并对鉴定为鸭疫里氏杆菌的分离株进行血清型和耐药性分析。利用标志基因整合酶的特异性引物PCR鉴定分离菌基因组,判断是否整合有50K基因岛。【结果】分离鉴定了3株鸭疫里氏杆菌,3株分离菌均能在TSA平皿培养基中生长为光滑的半透明状菌落,革兰氏染色为阴性、瑞氏染色可观察到两极浓染;生化试验结果显示,3株鸭疫里氏杆菌均不发酵多种糖类,过氧化氢酶阳性,不产硫化氢,不能液化明胶。16S rRNA鉴定结果显示,获得大小为1480 bp的目的条带,血清型均为1型;50K基因岛标志基因PCR扩增结果显示,仅黄梅分离株(HM株)含有该基因岛。最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)试验与纸片扩散(Kirby-Bauer,K-B)试验测定耐药性结果显示,3株分离菌株均对青霉素、阿莫西林、头孢曲松、头孢噻肟、氟苯尼考及庆大霉素敏感,对萘啶酮酸、壮观霉素、恩诺沙星、多黏菌素B表现出不同程度的耐药性。【结论】分离鉴定了3株血清1型鸭疫里氏杆菌,药敏试验结果对本地区鸭疫里氏杆菌病的防治及流行病学研究提供一定的理论指导。

鸡毒支原体和滑液囊支原体四重PCR检测方法的建立

为建立区分MG弱毒疫苗株F株和非F株以及滑液囊支原体的方法,试验通过分析NCBI上公布的MG和MS基因序列,优选合适的基因序列设计合成了MG弱毒疫苗株F株特异性引物、非F株MG通用引物、MG通用引物以及MS通用引物,各引物扩增条带大小分别为750、585、279和421bp,建立了可以区分MG弱毒疫苗株F株与非F株以及滑液囊支原体的PCR检测方法。结果显示:各引物的特异性或通用性良好,检测限度可以达到100fg/μL。研究表明,该试验建立的四重PCR检测方法可用于MG弱毒疫苗株F株与非F株的鉴别诊断以及滑液囊支原体的检测,为该病的净化提供技术支持。

鸭疫里默氏杆菌KYF39_09285基因缺失株的构建及生物学特性研究

为研究KYF39_09285基因对鸭疫里默氏杆菌生物学特性及其对雏鸭致病力的影响,试验利用基因同源重组的原理构建KYF39_09285的基因缺失株RA-YMΔKYF39_09285,并使用穿梭质粒构建其基因回补菌株,评价其对鸭疫里默氏杆菌生物学特性以及雏鸭致病力的影响。结果显示:与亲本株相比,KYF39_09285基因缺失株的生长速度、生化特性、对Vero细胞的黏附入侵能力均未发生改变,但缺失株中dnaK表达量降低,对高渗、青霉素、氨苄西林、庆大霉素和链霉素的敏感性增强,对雏鸭的致病力(LD_(50))降低1.84倍,45℃胁迫下的KYF39_09285表达量显著降低。研究表明KYF39_09285与鸭疫里默氏杆菌对高温、高渗和抗生素的耐受性以及致病力有关,结果为深入研究鸭疫里默氏杆菌的致病机制奠定基础。

鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的克隆与表达

利用本实验室分离、鉴定并保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型湖北云梦分离株(RA-YM),根据GenBank上的序列设计了1对引物,用PCR方法扩增了RA-YM株的主要外膜蛋白OmpA基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果表明OmpA基因全长1152bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与其他不同RA菌株OmpA基因之间的核苷酸序列同源性为93%～97%。用pGEX-KG构建了原核表达载体pKG-OmpA,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白大小约为68000,Western-blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。

蛋鸡无抗养殖技术实践

目前,蛋鸡生产中使用抗生素引发的食品安全问题较多,本文从蛋鸡无抗养殖的认识、无抗养殖技术技术体系关键控制点、蛋鸡无抗养殖技术实践及效益等方面出发,分析了蛋鸡无抗养殖技术的应用现状及发展前景。

牛白血病病毒env(gp51)基因的克隆和原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

从持续感染牛白血病病毒(BLV)的羊胎肾细胞(FLK-BLV)中提取前病毒DNA,用PCR方法扩增编码牛白血病病毒gp51蛋白的env(gp51)基因,序列测定结果表明扩增片段全长828 bp。将扩增基因插入原核表达载体pET-32a构建pET-32a-gp51重组质粒,转化BL21(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明重组融合蛋白大小约为43 000,Western-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白gp51作为抗原,建立检测BLV抗体的间接ELISA诊断方法。结果表明,抗原gp51的最佳包被浓度为2.19μg.mL-1,血清的最佳稀释倍数为1∶80,阳性判定标准确定为样品OD450 nm大于0.451。用该方法对12份参考血清进行检测,准确率为91.67%。

蛋鸡白血病的PCR检测和序列分析

采用PCR方法对某蛋鸡场送检感染鸡进行实验室诊断,针对禽白血病病毒逆转录酶3’区域设计鉴定内外源病毒共同下游引物H5,针对ALV-J亚群gp85囊膜糖蛋白基因保守区域设计上游引物H7,A-E亚群gp85囊膜糖蛋白基因保守区域设计上游引物AD1,提取肝脏病料中核酸进行PCR扩增,测序分析结果表明为内源性禽白血病病毒感染。

鸽Ⅰ型副粘病毒病研究进展

鸽Ⅰ型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus 1,PPMV-Ⅰ)病是由禽Ⅰ型副粘病毒引起的、流行于鸽群的一种高度接触性急性传染病,是危害养鸽业的主要疫病之一。概述了PPMV-Ⅰ病的病原学、流行病学、临床症状、病理变化、诊断和防治措施等方面的研究进展,提出了需进一步研究的问题。

鸡场土壤中大肠杆菌的检测与化学消毒剂筛选

应用平板计数法和大肠菌群最大或然数(MPN)法对44份养鸡场土壤样品污染情况进行测定,结果表明春秋季土壤污染较夏冬季严重;以从养鸡场土壤样品中分离鉴定的大肠杆菌作为指示菌,对戊二醛和二氧化氯的杀菌效力进行了测定,定量悬浮试验结果表明0.01%戊二醛作用30 min、0.02%戊二醛作用5 min、25 mg/L二氧化氯作用10 min,对大肠杆菌的杀灭率均达到100%。以土壤为载体的消毒试验结果表明0.01%戊二醛作用30 min、0.02%戊二醛作用10 min和300 mg/L二氧化氯作用30 min、400 mg/L二氧化氯作用10 min,对大肠杆菌的杀灭率均达到100%,两种消毒剂均具有良好的杀灭效果。

幼兔肝型球虫病的诊断和防治

2005年7月初,湖北省咸宁市某家兔饲养户发生一起幼兔以侵害肝脏为主的病例。根据流行病学、临床症状、病理变化以及实验室虫卵检查,确诊为幼兔肝型球虫病。经用药治疗,病情得到控制。

地方鸡禽白血病病毒感染调查及主要流行亚群分析

为了解湖北省地方鸡禽白血病病毒的感染状态及主要流行亚群,从麻城绿壳蛋鸡、江汉鸡、景阳鸡3个地方品种核心群采集了7477份样品,进行蛋清p27抗原检测、公鸡病毒分离鉴定及分离株gp85基因序列分析。结果显示:3个地方鸡种蛋清p27抗原阳性率分别为1.32%、6.54%和2.82%,公鸡病毒分离率为6.11%、30.14%和8.64%,表明湖北省地方鸡禽白血病病毒感染比较严重,不同品种的感染率不同,公鸡的排毒率高于母鸡。利用PCR方法将分离的15株禽白血病病毒分为两大亚群,分离株gp85基因遗传进化分析结果显示,3个地方鸡品种主要流行J、K亚群禽白血病病毒,均存在J、K亚群禽白血病病毒的共感染,表明湖北省地方鸡禽白血病病毒感染情况较为复杂。

益生枯草芽胞杆菌HDRaBS1缓解蛋鸡热应激效果

选取868只280日龄产蛋率相近海兰褐蛋鸡,随机分为高温组(33℃)、益生菌组(枯草芽胞杆菌+33℃)、室温组(26℃),试验期为20 d,研究益生枯草芽胞杆菌HDRa BS1缓解动物热应激的可行性及其机制。结果发现,与高温组相比,益生菌组在全期产蛋率、平均日采食量、平均蛋质量方面分别提高了2.60%(P<0.05)、2.91%(P>0.05)和0.96%(P>0.05),但没有达到室温组水平,且在腹泻率、蛋破损率方面均有降低;血清内毒素、IL-1水平分别降低了37.41%(P>0.05)和20.98%(P<0.05),IL-10含量提高了41.05%(P>0.05);益生菌显著上调盲肠紧密连接基因occludin、ZO-1和JAM-A mRNA的表达(P<0.05),上调肠黏膜修复基因EGF mRNA的表达(P<0.05),显著提高肠绒毛高度,而隐窝深度之间无显著差异(P>0.05)。因此,添加枯草芽胞杆菌HDRa BS1能有效缓解蛋鸡热应激症状。

华中地区鸡源沙门菌分离鉴定及耐药性分析

为了探明华中地区种鸡场沙门菌(Salmonella)的优势血清型和耐药情况,本研究从湖北、河南、湖南等省市22个规模化鸡场采集病鸡、死胚及弱雏组织样品3 724份,通过分离培养、生化试验、PCR鉴定及血清型试验确定分离菌种属及其血清型,并采用Kirby-Bauer法对分离菌株进行了耐药性分析。结果显示,本试验从3 724份病料中共分离鉴定出124株沙门菌,其中79株为D群肠炎沙门菌(63.71%,79/124),34株为D群鸡白痢沙门菌(27.42%,34/124),8株为B群鼠伤寒沙门菌(6.45%,8/124),有3株沙门菌未能确定血清型。O抗原鉴定79株肠炎沙门菌和34株鸡白痢沙门菌为O9,8株鼠伤寒沙门菌为O4。H抗原鉴定79株肠炎沙门菌为Hg,m,8株鼠伤寒沙门菌为Hi。药敏试验结果显示,124株分离菌株对萘啶酸、氨苄青霉素、四环素和多西环素耐药率分别为95.97%(119/124)、91.94%(114/124)、57.26%(71/124)和70.16%(87/124);对复方新诺明和红霉素耐药率分别为25.81%(32/124)和12.10%(15/124);对氯霉素、庆大霉素、头孢噻肟和卡那霉素耐药率分别为6.45%(8/124)、1.61%(2/124)、1.61%(2/124)和0.81%(1/124);对左氧氟沙星、阿米卡星和多黏菌素B完全敏感。99.19%(123/124)的分离株至少对一种药物耐药,87.10%(108/124)的分离株表现多重耐药。本研究为华中地区养鸡场沙门菌的诊断及防控提供了数据支撑。

枯草芽胞杆菌TL对断奶仔猪生长发育、肠道环境及健康状况的影响

选取120头杜×长×白三元杂交断奶仔猪,随机分成负对照组(基础日粮)、正对照组(基础日粮+2.5g/kg抗生素)、M1组(正对照组+150g/t抗生素)、M2组(正对照组+300g/t抗生素),试验期30d,研究枯草芽胞杆菌TL对断奶仔猪生长发育、肠道环境及健康状况的影响。结果发现:生长性能方面,与正对照组相比,M1组在体质量(断奶后30d)、平均日增重、平均日采食量方面分别提高7.81%(P<0.05)、17.14%(P<0.01)和33.10%(P<0.01),且M1组和M2组可以极显著降低断奶仔猪的腹泻率。血液指标方面,与正对照组相比,M1组血清GSH-Px、T-SOD分别提高9.0%(P<0.05)和32.78%(P<0.01),MDA降低43.71%(P<0.05),猪瘟抗体水平提高14.06(P<0.05)。肠道屏障方面,与正对照组相比,M1组可显著提高小肠绒毛高度,降低隐窝深度;与正、负对照组相比,M1组、M2组可显著提高盲肠乳酸杆菌数量,降低大肠杆菌数量。由此得出,枯草芽胞杆菌可显著提高断奶仔猪的生长性能,改善仔猪肠道环境及健康状况。

湖北省地方鸡核心群禽白血病净化的初步研究

试验针对湖北省地方鸡江汉鸡核心群进行禽白血病初步净化。禽白血病病毒感染本底调查结果显示,该种鸡群存在A/B亚群、J亚群禽白血病病毒感染,父系精液病毒分离率为7.1%,高于种蛋蛋清p27抗原阳性率2.5%。采用1日龄胎粪p27抗原检测,开产初期和留种前的种蛋蛋清p27抗原检测、父系公鸡血浆及精液病毒分离的方法,结合生物安全措施,对核心种群开展了净化淘汰,结果显示:经过两个世代的净化,种蛋蛋清p27抗原阳性率由2.7%降至0.5%,公鸡病毒分离阳性率由8.6%降至1.7%,阳性率显著降低。表明该净化方案实施效果明显,适于进一步推广应用。

发酵中药微生态制剂对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和抗氧化能力的影响

旨在研究发酵中药微生态制剂对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和抗氧化能力的影响。选用23日龄断奶的杜×长×大三元杂交健康仔猪120头,随机分为4组:对照组饲喂基础日粮、抗生素组(基础日粮+0.075 g/kg金霉素+0.015 g/kg恩拉霉素+0.1 g/kg喹乙醇)、试验Ⅰ组(基础日粮+0.3%发酵中药+0.15 g/kg枯草芽孢杆菌TL)、试验Ⅱ组(基础日粮+0.3%发酵中药+0.3 g/kg枯草芽孢杆菌TL),每组3个重复,每个重复10头,试验期30 d。结果表明,试验Ⅰ组的平均日增重高于对照组(P<0.01),料肉比较对照组降低(P<0.05),与抗生素组相比,差异均不显著。试验Ⅰ组、Ⅱ组的腹泻率低于对照组和抗生素组(P<0.01)。与对照组和抗生素组相比,试验Ⅰ组、Ⅱ组的血清总蛋白、葡萄糖浓度上升(P<0.05),甘油三酯浓度下降(P<0.05)。在血清抗氧化指标方面,试验Ⅰ组和Ⅱ组的血清T-SOD、GSH-Px活性显著高于抗生素组,MDA含量显著降低。由此可见,发酵中药微生态制剂具有与抗生素相当的促生长能力,能够降低断奶仔猪腹泻率、增强免疫功能、提高机体抗氧化能力。

发酵中药制剂对肉鸡生产性能、免疫功能、肠道形态及盲肠菌群影响的研究

选取1日龄AA肉鸡288只,随机分为对照组(基础日粮)、抗生素组(基础日粮中+50 g/t金霉素)和发酵中药制剂组(基础日粮+3 kg/t发酵中药制剂),试验周期为42 d,研究发酵中药制剂对肉鸡生产性能、血清抗氧化指标、免疫功能、肠道形态和盲肠菌群的影响。结果表明,发酵中药制剂组出栏均重高于对照组和试验组,平均日增重比对照组和抗生素组分别提高8.19%(P<0.05)和4.61%(P<0.05),料肉比与对照组显著降低,比抗生素组降低0.02(P>0.05);发酵中药制剂改善了血清抗氧化指标;与抗生素组相比,发酵中药制剂组胸腺指数增加了61.96%(P<0.05),血清IL-1β、内毒素的含量分别降低28.73%(P<0.05)、23.36%(P<0.05),IL-6、IL-10含量分别提高117.63%(P<0.05)、36.85%(P>0.05)。发酵中药制剂组回肠、盲肠黏膜sIgA含量较对照组分别增加44.2%(P<0.05)和66.9%(P<0.05),较抗生素组分增加43.4%(P<0.05)和65.5%(P<0.05)。相比对照组和抗生素组,发酵中药制剂组回肠、盲肠VH/VD值显著提高。发酵中药制剂组乳酸杆菌含量最高,比对照组和抗生素组提高40.66%、24.27%(P<0.05),普氏粪杆菌的数量提高了12.44%和3.42%(P<0.05),沙门氏菌含量比对照组和抗生素组降低了17.76%、20.96%(P<0.05)。发酵中药制剂具有良好的益生功能,可以提高机体的抗病力,调节肠道形态结构及有益菌群,促进生产性能。

丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡生产性能、肠道形态和菌群的影响

本研究旨在探讨丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂对肉鸡生产性能、肠道形态和菌群结构的影响。选取1日龄Cobb500肉鸡15000只,随机分为5组,每组3个重复,每个重复1000只,分别饲喂:A组为基础日粮、B组含有50 g/t金霉素的日粮、C1、C2和D组分别在基础日粮中添加100 g/t丁酸梭菌CB1制剂、200 g/t丁酸梭菌CB1制剂、200 g/t丁酸梭菌CB1制剂复合菌制剂,试验期为42 d。试验结果表明,C1、C2和D组1~21 d平均日增重高于B组(P<0.05或P<0.01),D组1~42 d平均日增重与B组相当(P>0.05),C2组和D组的料肉比、死亡率均明显低于A组和B组,D组盲肠绒毛高度和VH/CD值最高。在日粮中添加丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡回肠、盲肠乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖有显著促进作用。由此可见,丁酸梭菌CB1复合菌制剂具有与金霉素相当的促生长效果,在日粮中添加丁酸梭菌CB1制剂可以显著提高肠道绒毛高度和VH/CD值,有效促进肉鸡的生长性能,促进肠道形态发育,改善肠道菌群。

发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道结构、肠组织基因表达及肠道菌群的影响

选用23日龄断奶的杜长大三元杂交健康仔猪120头,随机分为对照组(基础日粮)、抗生素组(基础日粮+0.075 g/kg金霉素+0.015 g/kg恩拉霉素+0.1 g/kg喹乙醇)、试验Ⅰ组(基础日粮+0.3%发酵中药制剂+0.15 g/kg枯草芽孢杆菌TL)、试验Ⅱ组(基础日粮+0.3%发酵中药制剂+0.3 g/kg枯草芽孢杆菌TL)4组,每组30头,试验周期30 d,评价发酵中药微生态制剂对断奶应激肠道结构、肠组织基因表达及肠道菌群的影响。结果表明,试验Ⅰ组十二指肠、空肠和回肠的绒毛长度/隐窝深度(VH/CD)值最高,比对照组分别提高32.27%(P<0.01)、37.23%(P<0.01)和56.23%(P<0.01)。与对照组相比,抗生素组和试验Ⅰ组MUC2基因表达上调,但差异不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组大肠杆菌数量降低,与对照组差异不显著(P>0.05);试验Ⅰ组、试验Ⅱ组乳酸杆菌数量分别比对照组提高21.22%、14.32%(P<0.05),比抗生素组提高33.70%(P<0.01)、26.09%(P<0.05)。发酵中药微生态制剂可以提高十二指肠、空肠和回肠VH/CD值,促进盲肠内容物乳酸杆菌繁殖,降低盲肠内容物大肠杆菌数量。