向日葵HaLACS9基因的克隆与功能分析

长链酰基CoA合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase,LACS)催化游离脂肪酸合成酰基CoA,在植物脂质代谢中发挥重要作用。本研究从向日葵中筛选并克隆得到1个LACS家族基因HaLACS9,同源比对表明HaLACS9具有LACS酶的保守结构域,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、莴苣(Lactuca sativa)和刺菜蓟(Cynara cardunculus)LACS9蛋白具有较高的相似性。亚细胞定位预测HaLACS9定位于叶绿体。HaLACS9启动子区含有多种逆境及激素响应相关元件。qRT-PCR分析表明,HaLACS9在向日葵多个器官中表达,在花后10 d的种子中优势表达。干旱、盐、外源脱落酸和赤霉素处理均能诱导HaLACS9基因在向日葵根、茎和叶中的表达。分析HaLACS9在向日葵种子发育不同时期的相对表达量发现,HaLACS9在向日葵种仁发育早期高水平表达,与籽油的快速积累密切相关。随着种子发育和籽油积累速率的减慢,HaLACS9转录水平呈下降趋势。缺陷型酵母互补试验证明HaLACS9具有酰基CoA合成酶活性,并且油酸是其偏好的催化底物。推测HaLACS9与向日葵种子发育过程中的油脂积累和非生物胁迫响应相关。

向日葵HaLACS1的克隆、表达及酵母功能互补鉴定

探究长链酰基辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase,LACS)基因在向日葵(Helianthus annuus L.)油脂积累和逆境响应中的功能,为其在向日葵油脂合成和抗逆中的应用奠定基础。通过RT-PCR克隆得到向日葵HaLACS1的CDS序列,运用生物信息学方法分析HaLACS1的特点。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测HaLACS1的组织表达特性及对NaCl、PEG和ABA的响应情况。通过构建GFP和HaLACS1的融合表达载体,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析。将HaLACS1转入酿酒酵母突变型菌株YB525中进行功能互补试验,并进行底物偏好性分析。结果显示,HaLACS1开放阅读框1 980 bp,编码659个氨基酸。蛋白进化树分析表明,HaLACS1与拟南芥AtLACS1和莴苣(Lactuca sativa)LsLACS1具有较高的相似性。拟南芥原生质体瞬时表达分析显示HaLACS1定位于内质网。实时荧光定量PCR结果显示,HaLACS1在所有组织中均有表达,但在种子发育的早期表达量较高,花次之。NaCl、PEG和ABA处理均能诱导HaLACS1在向日葵根、茎和叶中的表达。酵母功能互补试验证明HaLACS1蛋白具有LACS酶活性。底物偏好性分析表明HaLACS1偏好棕榈酸(C16:0)和油酸(C18:1)。表明HaLACS1与向日葵种子发育过程中的油脂积累和非生物胁迫响应相关。

向日葵LACS家族鉴定及响应非生物胁迫表达分析

利用生物信息学技术从向日葵(Helianthus annuus)基因组中鉴定了13个长链酰基辅酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthases,LACSs)家族基因,其分布在向日葵8条染色体上。系统发育树显示,HaLACS家族成员分为6个亚族,且同一亚族成员具有相似的基因结构和蛋白保守基序。基因复制分析发现HaLACS家族扩增的主要因素是片段复制。HaLACS的启动子区域富含逆境响应和植物激素调控相关元件。表达谱分析显示HaLACS在向日葵不同组织中的表达存在差异。比较2个向日葵品种(高/低亚油酸含量)中HaLACS在种子发育不同阶段的表达,HaLACS呈现差异表达。qRT-PCR结果表明,200mmol·L^(-1) NaCl处理24 h后,7个HaLACS在茎中的表达量与同期对照相比显著上调;100μmol·L^(-1) ABA处理3 h后,8个HaLACS在根中的表达量显著上调;15%PEG 6000模拟干旱胁迫后,多数HaLACS在不同组织中呈现诱导表达。综上,向日葵LACS基因家族不仅参与了向日葵脂质的合成,而且在应对非生物胁迫时发挥重要作用。

油葵(Helianthus annuus)HaDGAT1基因的克隆与生物信息学分析

油葵(Helianthus annuus L.)种子富含不饱和脂肪酸,主要是亚油酸。亚油酸是人体必需的脂肪酸,能降低血液胆固醇,预防动脉粥样硬化,发挥抗癌作用。二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltrabsferase,DGAT)作为一种限速酶在油葵合成三酰甘油的过程中发挥重要作用。本研究通过对油葵种子转录组测序,利用PCR方法成功克隆得到一个DGAT1基因的c DNA序列,命名为HaDGAT1。对油葵HaDGAT1基因进行生物信息学分析,发现油葵HaDGAT1基因CDS全长1 440 bp,共编码479个氨基酸,所编码蛋白的分子量为55.740 kD,理论等电点为9.24。油葵Ha DGAT1为疏水性蛋白,亚细胞定位预测在内质网膜上。该蛋白的二级结构中α螺旋(44.05%),β转角(1.88%),延伸链(13.36%)和无规则卷曲(40.71%),与预测的蛋白质三级结构一致。本研究为进一步深入了解HaDGAT1基因的功能和调控机制和利用基因工程技术调节油葵脂肪酸的含量、改良油葵油的品质提供了理论依据。

油葵HaFAD2-5基因的克隆及其对低温和光照的响应

油葵(Helianthus annuus L.)是世界重要的油料作物之一,种子中含有大量亚油酸,但其合成与调控机制尚不清楚。本实验利用RT-PCR技术从油葵叶片中克隆了一个FAD2家族基因,命名为HaFAD2-5。并使用半定量RT-PCR分析其在低温和光照处理下的表达模式。结果表明,HaFAD2-5基因的开放阅读框(ORF)为1 113 bp,编码蛋白质含370个氨基酸,等电点(p I)为6.52,相对分子质量为43.21 kD。半定量RT-PCR表明,低温和光照处理可调节HaFAD2-5在油葵根、茎和叶中的表达,但响应程度不同。茎和叶中HaFAD2-5的表达量在低温下增高;暗处理1 d和2 d后,根和叶中HaFAD2-5的表达量下降;暗处理1 d后,茎中HaFAD2-5的表达量达到最高,暗处理2 d后又降低。研究表明,HaFAD2-5可能参与油葵对低温胁迫应答的调节,并且其表达具有昼夜节律性。

油葵三个HaLPAAT2基因的克隆、序列分析及活性鉴定

溶血磷脂酸酰基转移酶基因(lysophosphatideacid acyltransferases gene,LPAAT)是油脂合成的关键基因之一,其催化溶血磷脂酸合成磷脂酸,是高等植物Kennedy途径中的关键酶。本研究从油葵(Helianthus annuus)中克隆得到3个HaLPAAT2基因,分别命名为HaLPAAT2.1,HaLPAAT2.2和HaLPAAT2.3。对这3个HaLPAAT2进行了生物信息分析并将其转入SM2-1大肠杆菌突变体中验证LPAAT活性。结果表明:HaLPAAT2.1、HaLPAAT2.2和HaLPAAT2.3基因全长分别为1158、1137、1149 bp,分别编码385、378、382个氨基酸。预测3个基因的编码蛋白都含有LPLAT superfamily酰基转移酶结构域。跨膜结构分析显示这3个HaLPAAT2蛋白都含有3个跨膜结构域。亚细胞定位预测这3个蛋白都位于内质网上。对其理化性质分析表明这3个HaLPAAT2均为不稳定性蛋白。构建了HaLPAAT2.1、HaLPAAT2.2和HaLPAAT2.3基因的原核表达载体,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)功能缺失突变体SM2-1进行功能验证。互补试验表明,3个HaLPAAT2基因都具有大肠杆菌LPAAT活性,可以互补大肠杆菌LPAAT突变体SM2-1菌株的活性。

油葵(Helianthus annuus L.)HaFAD2-9基因的克隆与表达分析

FAD2基因在植物脂肪酸的生物合成、发育和对非生物胁迫的响应中发挥重要作用。为探究油葵FAD2-9基因具体的生物学功能,本研究从油葵中克隆得到HaFAD2-9基因,对其生物信息学和表达模式进行分析。结果表明,HaFAD2-9基因的ORF全长为1 146 bp,编码381个氨基酸,转录后蛋白的相对分子量为43.9 kD,等电点为6.69,有5个跨膜结构域,亚细胞定位显示其定位在内质网。HaFAD2-9蛋白含有三个保守的组氨酸簇[HECGHH, HRRHH和HV(A/L)HH]。分子系统进化分析显示,HaFAD2-9与红花(Carthamus tinctorius)和黄花蒿(Artemisia annua)的亲缘关系较近。该基因在根、茎、叶、子叶及授粉后不同时期的种子中均有表达,在17 DAF表达量最高,低温、盐、干旱和ABA均能诱导HaFAD2-9基因的表达。本研究为油葵应对非生物胁迫提供参考,为作物遗传改良提供候选基因。