组织蛋白酶L对脊髓损伤后小胶质细胞极化的影响研究

目的从小鼠小胶质细胞在脊髓损伤前后的表型变化入手,寻找通过调控小胶质细胞极化从而影响脊髓功能的基因。方法利用基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)的GSE172167数据集,分析小鼠在脊髓损伤前后的脊髓组织单细胞测序数据,采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和一致流形近似与投影t-分布随机邻域嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding,t-SNE)降维,获得10个亚群细胞,并筛选出脊髓损伤后小胶质细胞中高表达的差异基因。2023年2月至2023年4月采用BV2细胞和C57BL/6小鼠进行前瞻性研究,验证组织蛋白酶L(cathepsin-L,CTSL)的功能和作用机制。首先将BV2细胞分为7组:对照组,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组,白细胞介素(interleukin,IL)-4组,阴性对照(NC)-shRNA组,敲低(sh)-CTSL组,NC-过表达(OE)组,OE-CTSL组。动物模型分为5组:假手术(sham)组,脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)组,sh-CTSL组,OE-CTSL组,空白组。实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和蛋白质印迹法(western blot,WB)检测CTSL的mRNA和蛋白水平,qPCR检测肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)-α和IL-1β。流式细胞术检测M1型小胶质细胞(CD86+/CD80+)和M2型小胶质细胞(CD163+/CD206+)占比比例。免疫荧光染色检测小鼠脊髓组织中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)阳性细胞数和Arg-1阳性细胞数。另外,评估5组小鼠在0、1、2、3、4周的运动神经功能(basso-beattie-bresnahan,BBB)评分。结果体外细胞实验中,对照组M1型小胶质细胞比例、IL-1β、TNF-α和M2型小胶质细胞比例均低于LPS组;LPS组M1型小胶质细胞比例、IL-1β和TNF-α高于IL-4组,而M2型小胶质细胞比例则低于IL-4组;sh-CTSL组M1型小胶质细胞比例、IL-1β和TNF-α均低于LPS组和NC-shRNA组,而M2型小胶质细胞比例则高于这两组;OE-CTSL组M1型小胶质细胞比例、IL-1β和TNF-α均高于IL-4组和NC-OE组,而M2型小胶质细胞比例则低于这两组;体内动物实验中,术后3、4周时,sh-CTSL组BBB评分高于SCI组和空白组,OE-CTSL组BBB评分则低于这两组。在脊髓组织中,sham组的M1型小胶质细胞比例、iNOS阳性细胞数、IL-1β、TNF-α、M2型小胶质细胞比例和Arg-1阳性细胞数均低于SCI组和空白组;OE-CTSL组中,M1型小胶质细胞比例、iNOS阳性细胞数、IL-1β、TNF-α高于SCI组和空白组,而M2型小胶质细胞比例和Arg-1阳性细胞数低于SCI组和空白组。sh-CTSL脊髓组织中的M1型小胶质细胞比例、iNOS阳性细胞数、IL-1β和TNF-α低于SCI组和空白组,而M2型小胶质细胞比例和Arg-1阳性细胞数高于SCI组和空白组。以上所有差异均有统计学意义(P<0.05)。结论sh-CTSL能够促进小鼠脊髓M1型小胶质细胞转化为M2型,减轻炎症反应,促进小鼠脊髓损伤修复。