布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建及免疫效果分析

利用Overlap PCR方法连接基因L7/L12和GroES,分别利用pET32a和pcDNA3.1构建原核和真核表达质粒,分别命名为pET32a-LG和pcDNA3.1-LG。原核表达并纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,用于验证真核表达载体目的基因的表达;重组真核表达质粒pcDNA3.1-LG转染293T细胞,经间接免疫荧光和Western blot验证蛋白成功表达。真核质粒免疫小鼠后,利用ELISA方法检测血清抗体水平,淋巴细胞转化试验检测细胞免疫水平,结果显示,该重组质粒具有良好的免疫效果。

肠炎沙门菌glpK基因缺失株的生物学特性及其免疫效果评价的研究

为分析甘油激酶(GlpK)对肠炎沙门菌毒力的影响,本研究使用野生菌株c50336和glpK基因缺失菌株c50336ΔglpK进行体外模拟应激试验,分析glpK基因缺失对沙门菌抵抗应激环境的影响。将这两株菌分别以MOI 100感染鼠源巨噬细胞Raw264.7,在不同时间点计算胞内存活的细菌数,以评价glpK基因的缺失对沙门菌胞内存活率的影响;将菌株c50336和c50336ΔglpK腹腔注射小鼠,利用寇氏法计算各菌株对小鼠的半数致死量(LD;)。结果显示,与c50336相比,c50336ΔglpK在氧化和高渗环境中的存活率极显著降低(0.001<P<0.01),但在酸性和碱性环境中的存活率无明显变化,且在巨噬细胞内的存活率明显降低;LD_(50)测定结果显示,c50336ΔglpK和c50336对小鼠的LD_(50)分别为1.6×10^(7) cfu和6.7×10^(2) cfu。将菌株c50336ΔglpK以2.1×10^(6)cfu/只的剂量免疫BALB/c小鼠,14d后二免,首免28d时,以1.5×10^(5) cfu/只注射菌株c50336,计算15 d内小鼠的免疫保护率;按上述方法免疫小鼠一次,分别在免疫后3d、10d和21d,对各组小鼠采血分离血清,经间接ELISA检测小鼠血清抗体水平;取脾脏称重,计算脾脏指数;采用细菌计数法测定小鼠脾脏载菌量;制备免疫小鼠脾淋巴细胞悬液,分别经c50336ΔglpK全菌蛋白和ConA刺激,72 h后采用MTT法检测各组小鼠脾细胞的增殖能力。免疫保护率结果显示,glpK缺失株可对免疫小鼠提供100%的保护率,而攻菌对照组小鼠在攻菌后12 d全部死亡。脾脏指数和载菌量检测结果显示,与对照组相比,免疫后3d、10 d和21 d的免疫组小鼠脾脏指数均极显著升高(0.001<P<0.01),且10 d时脾脏指数最高;小鼠脾脏载菌量逐渐降低,并在免疫后21 d脾脏细菌被完全清除。血清抗体检测结果显示,免疫组小鼠抗体水平随免疫次数的增加而升高,而对照组小鼠血清抗体一直为阴性。淋巴细胞增殖能力检测结果显示,c50336ΔglpK全菌蛋白刺激的小鼠脾细胞增殖指数随免疫次数的增加而升高,与对照组差异均极显著(0.001<P<0.01).本研究结果首次证实glpK与肠炎沙门菌的毒力密切相关,且其缺失菌株可对小鼠提供良好的免疫保护。本研究为肠炎沙门菌glpK缺失株疫苗的研究奠定了基础。

鸡传染性法氏囊病的诊治

鸡传染性法氏囊病是一种由传染性法氏囊病病毒引起的对鸡有严重危害性的免疫抑制性、高度接触性传染病。本文分析了鸡传染性法氏囊病的临床表现、病理剖检、实验室检测和治疗方法,并提出了加强鸡舍环境卫生防控、严格卫生消毒、定期疫苗免疫等预防措施。

entB和entC基因缺失对肠炎沙门菌生物学特性影响的研究

为研究肠炎沙门菌肠杆菌素相关因子(entB)和异分支酸酶(entC)两个基因的作用,本研究利用λ-Red重组技术构建了肠炎沙门菌entC、entB单基因和双基因缺失菌株,在不同时间点检测菌液OD_(600nm)值并绘制生长曲线,利用ATB自动生化鉴定系统对其进行生化鉴定,并进行酸(pH3.5)、碱(pH10.0)、氧化应激(10 mmoL/L H2O2)体外模拟应激试验和小鼠的感染试验,分析基因entC和entB对肠炎沙门菌的影响。结果显示,通过同源重组技术,将氯霉素基因同源替换entC和entB基因,正确构建了单基因缺失菌株(c50336ΔentC和c50336ΔentB)及双基因缺失菌株(c50336ΔentC-entB);绘制的生长曲线结果显示,与c50336相比,单基因缺失株c50336ΔentC和c50336ΔentB生长延缓,双基因缺失株c50336ΔentC-entB生长延缓得更加明显;生化鉴定显示,基因entC和entB对肠炎沙门菌的部分生化特性有一定的影响;体外应激试验显示,双基因缺失菌株c50336ΔentC-entB显著降低肠炎沙门菌对酸、碱和氧化应激环境的抵御能力;动物感染试验结果显示双基因缺失菌株c50336ΔentC-entB对小鼠的毒力显著降低。本研究首次证实了entC和entB基因不同程度影响肠炎沙门菌的生长、抗应激能力和毒力,为深入研究entC和entB基因对肠炎沙门菌致病机制的影响奠定基础。

GlpK影响肠炎沙门菌生物被膜形成

为研究肠炎沙门菌甘油激酶GlpK的功能,利用同源重组技术构建了肠炎沙门菌GlpK基因敲除株c50336ΔglpK,通过药物敏感性和生物被膜相关实验探究其在肠炎沙门菌生物被膜形成中的作用。研究结果显示,GlpK基因敲除后不影响细菌的体外生长,但可显著降低肠炎沙门菌形成生物被膜的能力和药物敏感性,且肠炎沙门菌Curli菌毛和纤维素的形成受到抑制,生物被膜相关基因的表达下调。研究结果表明GlpK基因参与肠炎沙门菌的耐药性和生物被膜形成,为肠炎沙门菌新型靶向药物的研发奠定了重要基础。