Wnt7a基因对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及向神经元样细胞分化的影响

目的研究Wnt7a基因过表达对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和向神经元样细胞分化的影响。方法构建Wnt7a腺病毒,利用病毒感染MSCs,MTT法检测Wnt7a基因腺病毒感染前后MSCs增殖情况,Western blot检测细胞质和细胞核中β-catenin及CyclinD1表达的变化,比较诱导后向神经元样细胞的分化率。结果与对照组细胞相比,Wnt7a腺病毒感染组细胞增殖能力明显增强(P<0.05);细胞质和细胞核中β-catenin蛋白表达量均明显增加(P<0.05);CyclinD1的蛋白表达量也明显增加(P<0.05);诱导后向神经元样细胞分化率明显提高。结论 Wnt7a蛋白表达上调,可能通过提高β-catenin和CyclinD1表达来促进MSCs细胞增殖,Wnt7a蛋白同时促进MSCs向神经元样细胞的诱导分化。

大鼠骨髓间充质干细胞与脱细胞脊髓支架体外共培养

目的评价脱细胞脊髓支架在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养中的作用,探索最佳接种浓度。方法分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,诱导BMSCs向神经元样细胞分化。制备脱细胞脊髓支架,将第3代BMSCs同脱细胞脊髓支架共培养,MTT法检测细胞增殖活性,比较与普通培养的差异;取第3代BMSCs以不同浓度[(0.5、1、2、3、4)×106/mL]接种于支架(脊髓支架修整0.5cm小段),检测细胞在支架上的粘附率及上架细胞数,建立接种浓度与细胞粘附率、上架细胞数的关系回归方程;扫描电镜观察脱细胞脊髓支架形态以及细胞与支架的粘附情况。结果成功实现BMSCs的分离及培养,BMSCs流式鉴定CD29、CD90阳性表达,向神经元诱导胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)呈阳性表达;与普通培养相比,BMSCs在支架上细胞增殖活力显著提高(P<0.05);细胞与支架的粘附率在接种浓度为2×106/mL最高,达到(79.6±2.7)%,单位体积上架细胞数达到(1.364±0.047)×106/cm3;扫描电镜观察支架空间结构良好,细胞与支架粘附良好,共培养第3天较第1天细胞数量明显增加。结论脱细胞脊髓支架具有多通道的空间结构,适合BMSCs粘附、存活、增殖,该支架是良好的天然脊髓组织工程材料。当粘附率及细胞上架数基本达到最大时的最佳接种浓度为2×106/mL。

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化研究的体外实验

目的分离培养较高纯度大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),检测其多向分化潜能。方法采用密度梯度离心结合差速贴壁法分离培养大鼠BMSCs,观察细胞形态,检测表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90表达情况,及其成骨、成脂、成神经诱导后茜素红染色、油红O染色和NSE、GFAP免疫荧光染色情况。结果细胞呈典型的成纤维细胞样形态,CD44和CD90呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达,细胞纯度>98%。成骨、成脂、成神经诱导后,茜素红染色、油红O染色、NSE和GFAP免疫荧光均为阳性。结论密度梯度离心结合差速贴壁法可分离、培养出高纯度的大鼠BMSCs,该细胞具有成脂、成骨、成神经多向分化潜能,是脊髓损伤修复的一种较理想的种子细胞。

小关节囊封闭术辅助治疗高龄骨质疏松性胸腰椎骨折的效果评价

胸腰椎骨折需要立即展开手术干预,而对年龄较高的患者而言,常常合并骨质疏松病症,为保证临床手术安全性,减少风险因素,本文引入联合手术方案,在常规单侧经皮椎体形成术的基础上,联合应用小关节囊封闭术,探究该项手术方案的积极性干预作用。方法 82例(2019.06-2023.01),对比不同手术方案的差异,将研究对比均等分为两个小组,对比组则采取常规手术方案,即应用频率相对较多的单侧经皮椎体形成术,试验组则采取联合手术方案,在上述干预方案上增添小关节囊封闭术。结果 试验组的手术时间更长,骨水泥注入量更少(P<0.05);但两组在Cobb角度矫正度数、椎体压缩改善度上无差异(P>0.05);术后24h、3月、6月的VAS评分更低,其术后24h、3月、6月的ODI评分更低(P<0.05);并发症更少得多(P<0.05)。结论 联合手术术中操作时间虽然长,但可以减少骨水泥注入量,也可有效减轻术后疼痛感,改善椎体功能,减少术后风险因素。

慢病毒转导增强型绿色荧光蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

[目的]研究慢病毒载体(lentiviral vectors,LVs)介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)标记大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的可行性及对细胞生物学特性的影响。[方法]采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,经Lenti-emGFP/hygro慢病毒载体转染和潮霉素药筛,镜下观察细胞形态和eGFP表达情况,MTT法检查转染前后细胞增殖活力,流式细胞仪检测细胞表面标记物(CD34、CD44、CD45、CD90)和eGFP,检测转染后细胞的成骨、成脂分化潜能并分别行茜素红染、油红O染色鉴定。[结果]大鼠BMSCs呈成纤维细胞样形态,漩涡样状排列,转染后细胞形态不变,并高效表达eGFP,两组细胞增殖活力一致,流式细胞仪检测显示,转染后的P3代大鼠BMSCs-eGFP的eGFP阳性率为99.97%,转染前后,两组细胞CD34和CD45阳性率低于2%,而CD44和CD90阳性率高于99%。转染后的P3代大鼠BMSCs-eGFP成骨诱导后,茜素红染色,可见呈桔红色的块状钙结节,成脂诱导后,油红O染色显示有大量红色脂质沉淀,成骨成脂诱导过程中,eGFP持续表达。[结论]Lenti-emGFP/hygro转染大鼠BMSCs并经潮霉素药筛后,eGFP可稳定高效表达,对细胞的生物学特性无明显影响,是一种较为理想的标记方法。

超声辅助脱细胞脊髓支架的生物学特性研究

目的采用超声振荡结合化学萃取法制备大鼠脱细胞脊髓支架，观察其三维结构及生物学特性，为脊髓组织工程研究提供理想的支架材料。方法采用超声振荡结合化学萃取（体积分数2％TritonX-100＋体积分数2％脱氧胆酸钠）方法对大鼠脊髓进行脱细胞处理（脱细胞脊髓组），对照正常大鼠脊髓组织（对照组），观察该脱细胞脊髓支架的大体形态、组织学及超微三维结构特点，并检测该支架材料的孔径大小、孔隙率、含水率、酶解率、在水溶液中稳定性等。结果脱细胞脊髓组原有的细胞成分被有效去除，具有（94．57±3．45）％的孔隙率和（88．62±1．0）％的含水率以及良好的三维空间结构（平均孔径为46μm），该支架在胰酶溶液中逐步降解，在第20小时达到（69．03±2．19）％，在双蒸水中逐步崩解，在第8天可达（62．55±1．70）％。正常脊髓组织结构紧密，含大量神经细胞及髓鞘，孔隙率和含水量分别为（0．04±0．02）％、（62．4±1．5）％，扫描电镜下未见明显孔隙结构，该支架在胰酶溶液中逐步降解，在第20小时达到（37．62±0．99）％，在双蒸水中逐步崩解，在第8天可达（40．97±0．81）％。结论超声振荡＋化学萃取所制备的脱细胞脊髓支架细胞成分去除彻底，细胞外基质成分保存完整，具有良好三维空间网状结构、良好的孔隙率和含水量，符合组织工程脊髓支架的理论要求，为组织工程脊髓支架提供理想的选择。

京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的制备及其生物力学特性研究

目的 构建京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架,探讨京尼平交联改性对大鼠脱细胞脊髓支架抗酶解能力、生物力学性能及细胞毒性的影响. 方法 采用化学萃取法制备大鼠脱细胞脊髓支架,再用5 g/L京尼平溶液进行化学交联改性.采用HE染色及扫描电镜观察未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的微观结构,测量基质孔径大小.分别检测交联前后大鼠脱细胞脊髓支架的孔隙率、含水率以及在2.5 g/L胰酶溶液中的失重率.在Instron生物力学测试仪上检测正常大鼠胸段脊髓、未交联及京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的极限牵张应力和弹性模量.将大鼠骨髓间充质干细胞分别在未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架浸提液中培养,采用MTT法检测细胞相对生长率,评价支架的细胞毒性. 结果 未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架拥有相似的三维网状孔隙结构,孔径大小约30 μm,孔隙率超过80％,两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；京尼平交联支架的含水率为（229.7±12.5）％,显著低于未交联支架的（283.4±11.2）％（P＜0.05）；京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架在胰酶溶液中各时相点的失重率明显低于未交联支架（P＜0.05）,生物力学测试其极限牵张应力和弹性模量则显著增强（P＜0.05）；未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架均未观察到明显的细胞毒性. 结论 京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架拥有与未交联支架相似的结构,但生物力学性能和抗酶解能力明显增强,且无明显细胞毒性,在脊髓损伤修复的组织工程研究中具有良好的应用前景.