牛肺炎链球菌重组PsaA蛋白对牛胚气管上皮细胞黏附抑制作用的研究

为研究牛肺炎链球菌的黏附蛋白—肺炎链球菌表面黏附素A (PsaA)对牛肺炎链球菌黏附牛胚气管上皮细胞的影响,本研究利用PCR扩增牛肺炎链球菌psaA基因,构建重组质粒pET32a-PsaA,经双酶切和测序鉴定正确后,将阳性重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot鉴定重组PsaA蛋白(rPsaA)的表达情况及反应原性,结果显示,rPsaA在上清和沉淀中均获得了表达,且具有较好的反应原性。将牛胚气管上皮细胞与1.3×10^(8)cfu/mL的牛肺炎链球菌稀释液于37℃共孵育后,利用间接免疫荧光试验(IFA)检测牛肺炎链球菌对牛胚气管上皮细胞的黏附性,结果显示,可观察到黏附在牛胚气管上皮细胞的牛肺炎链球菌的绿色荧光,即牛肺炎链球菌可以黏附牛胚气管上皮细胞。利用牛肺炎链球菌稀释液孵育经不同浓度rPsaA预处理的牛胚气管上皮细胞后,对黏附的细菌计数,结果显示,rPsaA可以极显著减少牛肺炎链球菌对牛胚气管上皮细胞的黏附菌数(P<0.01)。利用本研究制备的rPsaA多克隆抗体和肺炎链球菌阳性血清分别与牛肺炎链球菌作用后,与牛胚气管上皮细胞孵育,对黏附的细菌计数,结果显示,rPsaA多克隆抗体与肺炎链球菌阳性血清均能有效减少牛肺炎链球菌对牛胚气管上皮细胞的黏附数。本研究经原核系统表达了牛肺炎链球菌rPsaA,并首次证明rPsaA具有影响牛肺炎链球菌黏附牛胚气管上皮细胞的作用,该结果为探究抑制肺炎链球菌黏附呼吸道上皮细胞的机理以及肺炎链球菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。

奶牛乳房炎无乳链球菌Fc-Sip和金黄色葡萄球菌Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗的免疫试验研究

为探究由IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌(S.agalactiae,Sgc)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sau)保护性抗原亚单位疫苗的免疫效果,在本实验室前期研究基础上,本研究按体积11的比例将Sgc的Fc-Sip和Sau的Fc-FnBPB-ClfA两种蛋白分别与1%的盐酸左旋咪唑(1%LH)充分混合,制备两种亚单位疫苗。将即将干奶(妊娠220 d)、CMT试验为"++"以上的奶牛随机分为4组,分别将Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗(A组)、Fc-Sip亚单位疫苗(B组)、Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗(C组)通过首次肌肉免疫和二次乳头管灌注免疫方式进行免疫试验。通过免疫前后对乳样细菌分离、体细胞数测定及免疫血清抗体滴度测定,评价上述亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛的乳样细菌分离率分别为80%、90%、80%,其中Sgc检出率分别为20%、30%、10%,Sau检出率分别为30%、20%、10%;首免90 d后3个免疫组奶牛乳样细菌分离率分别降至20%、20%、40%,其中Sgc的检出率分别降至0、0、10%,Sau的检出率分别降至10%、10%、0,对照组免疫前后以上各项检测无明显变化。使用利拉伐牛奶体细胞检测仪检测免疫前后试验奶牛乳样中的体细胞数,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛体细胞数均值分别为6.19×105个/mL、5.16×105个/mL、5.49×105个/mL,首免90 d后3个免疫组奶牛乳样中体细胞数均值分别为2.05×105个/mL、2.04×105个/mL、2.52×105个/mL,而对照组奶牛乳样体细胞数与免疫前无明显变化。检测首免后0、7 d、14 d、28 d、60 d、90 d的血清抗体滴度,结果显示,首免后7 d,免疫组(A、B、C)80%的奶牛血清抗体滴度为11024;第14 d后,免疫组(A、B、C)90%奶牛血清抗体滴度达到12048;第28 d后,免疫组(A、B、C)80%奶牛血清抗体滴度在14096~18192,比对照组平均上升3~4个抗体滴度,对照组奶牛血清抗体滴度一直保持在1256~1512。综合分析以上试验结果显示免疫A组(Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA)综合免疫效果在各免疫组中最佳。本研究结果表明Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎具有较好的治疗和预防作用,为奶牛隐形乳房炎的防治提供了实验依据。

IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌保护性抗原Sip亚单位疫苗的研究

为研究无乳链球菌Fc-Sip亚单位疫苗的免疫效果,并验证IgGFcRn在奶牛乳腺发生局部免疫过程中的重要作用。本研究采用大肠杆菌原核表达系统,表达了由IgGFcRn介导无乳链球菌保护性表面抗原蛋白(Sip)的融合蛋白Fc-Sip,并与佐剂混合制成Fc-Sip亚单位疫苗。选取干奶前15 d的奶牛进行加州乳房炎检测法(CMT)检测,选取120头CMT(++)以上的奶牛进行分组免疫。通过免疫前后的细菌分离试验、牛奶体细胞数测定、免疫牛血清抗体间接ELISA检测来评价该亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前乳样细菌分菌率为86.6%,无乳链球菌检出率为46.6%;免疫后乳样分菌率降至40%,无乳链球菌检出率降至13.3%,表明Fc-Sip亚单位疫苗不但可以治疗无乳链球菌性奶牛乳房炎,还可以抑制其它奶牛乳房炎致病菌的侵入。首次免疫后60 d,免疫组80%奶牛血清抗体滴度达到1∶2 048～1∶4 096,对照组奶牛抗体滴度一直保持在1∶512。首次免疫后90 d,使用利拉伐牛奶体细胞计数仪测定实验奶牛乳样中的体细胞数,免疫组奶牛乳样体细胞数范围在0.17×10~5个/mL～3.91×10~5个/mL,对照组奶牛乳样体细胞数的范围在4.05×10~5个/mL～7.27×10~5个/mL。免疫组奶牛血清抗体滴度的升高及免疫后牛奶中体细胞数的减少,表明该亚单位疫苗促进了奶牛体液免疫反应和局部免疫反应的发生,也证明该亚单位疫苗具有降低牛奶体细胞数的作用。本研究为奶牛乳房炎无乳链球菌疫苗的研制奠定了基础。

牛支原体EF-Tu基因的克隆表达、亚细胞定位及间接ELISA方法建立

旨在获得牛支原体延伸因子EF-Tu蛋白,分析其在牛支原体菌体内的分布情况,建立EF-Tu间接ELISA法,为进一步研究牛支原体EF-Tu的生物学功能提供理论依据,也为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和亚单位疫苗的研制奠定基础。参照Uniprot数据库中M.bovis PG45株EF-Tu基因序列,应用Overlap PCR扩增获得EF-Tu基因并将其克隆至pMD19-T载体,测序正确后,构建pET32a-EF-Tu原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,IPTG诱导表达,纯化后的表达产物免疫新西兰兔(New Zealand rabbit)制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定高免血清抗体效价,用Western blot和间接ELISA法初步定位EF-Tu在菌体内的分布,通过优化反应条件,建立间接ELISA检测法。结果表明:重组蛋白EF-Tu约为66ku,主要以可溶性形式表达;采用间接ELISA测定的多克隆抗体效价为1:6400;Western blot和ELISA表明该蛋白在牛支原体细胞质和细胞膜中均有表达,且含量相当。利用EF-Tu建立的ELISA法具有很好的特异性和敏感性。通过原核表达系统成功得到牛支原体延伸因子的重组蛋白,该蛋白分布于菌体细胞质和膜表面,且含量基本相当。本研究所建立的EF-Tu ELISA法适合大规模的血清学诊断检测。

绵羊肺炎支原体P60_(58aa-928aa)蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法。【方法】利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式。以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性。以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测。【结果】经DNAStar分析,P60蛋白第58-928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8~1.7之间,亲水指数为0~2.0,证明该区域(P60_(58aa-928aa))抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P60_(58aa-928aa)基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性。对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4000,判定阴阳性血清的临界值为0.36。对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1∶2048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均<10%,证明该方法具有较好的重复性。利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6%,阴性符合率为92.6%,总符合率为88.0%。【结论】本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法。

奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌MrkD基因的原核表达及对乳腺上皮细胞黏附的研究

为探究奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌(K.pn)黏附素MrkD蛋白对K.pn黏附奶牛乳腺上皮细胞的影响以及黏附素抗血清对阻断K.pn黏附奶牛乳腺上皮细胞的效果,本研究利用PCR扩增了K.pn MrkD基因,构建重组质粒pColdI-MrkD,将其转化至大肠杆菌后诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot鉴定。结果显示,MrkD重组蛋白以可溶性形式表达,并具有较好的反应原性。将牛乳腺上皮细胞与1×10^(8)cfu/mL K.pn稀释液共同孵育后,利用间接免疫荧光试验检测K.pn对奶牛乳腺上皮细胞的黏附,结果显示K.pn可以黏附奶牛乳腺上皮细胞。利用K.pn稀释液孵育经不同浓度MrkD重组蛋白作用的奶牛乳腺上皮细胞后,通过对黏附细菌数的统计和分析,结果表明MrkD重组蛋白可以显著抑制K.pn黏附奶牛乳腺上皮细胞。利用MrkD重组蛋白抗血清和K.pn抗血清分别与K.pn作用后计数黏附的奶牛乳腺上皮细胞,结果显示,MrkD重组蛋白抗血清与K.pn抗血清均能有效阻断K.pn的黏附,且重组蛋白抗血清效果较好。本研究获得了MrkD重组蛋白,首次检测了其在K.pn黏附奶牛乳腺上皮细胞中的影响以及该重组蛋白抗血清在阻断K.pn黏附细胞中的作用,为探究阻断细菌黏附以及奶牛乳房炎亚单位疫苗的研究奠定基础。

牛呼吸道合胞体病毒G蛋白抗原区原核表达及反应原性鉴定

本研究旨在获得重组牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白并对其进行反应原性鉴定。从NCBI上找出G基因的核苷酸序列,分析其抗原区域,利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增BRSV G基因片段,将目的片段连接到克隆载体pMD19-T后,对其进行双酶切鉴定和测序。将双酶切后的目的片段进行胶回收,构建重组质粒pET-32a-G,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用Ni-IDA亲和层析法纯化经IPTG诱导表达的蛋白,并测定其浓度;通过SDS-PAGE和Western blotting方法对该蛋白进行分析与鉴定。结果显示,本试验成功克隆出大小约为567 bp的G基因,获得分子质量约为40 ku的可溶性重组蛋白,优化诱导条件后用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定,在16℃、IPTG浓度1.2 mmol/L、诱导4 h时蛋白表达量最大;通过Western blotting检测发现,重组蛋白可与山羊源BRSV标准阳性血清发生特异性反应,说明该蛋白具有反应原性。综上,本研究成功表达并纯化了BRSV G蛋白,为建立BRSV抗体间接ELISA检测方法和BRSV亚单位疫苗的研制奠定了基础。

BPIV3 NP蛋白的原核表达及其对BPIV3灭活疫苗免疫增强作用的研究

【目的】验证牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)NP蛋白对BPIV3灭活疫苗的免疫效果是否有增强作用。【方法】利用生物信息学软件对NP基因编码的蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性区域,采用PCR方法扩增BPIV3截短的NP基因序列,连接至pET-32a(+)质粒上,通过大肠杆菌原核表达系统和Ni亲和层析的方法获得了较高纯度的BPIV3 NP蛋白,经Western blotting验证其反应原性。将BPIV3用0.3%甲醛灭活后与弗氏佐剂1∶1混合制备灭活疫苗。8只新西兰白兔随机分为4组:灭活疫苗组、NP蛋白组、灭活疫苗和NP蛋白混合组及对照组,每组2只。免疫前及免疫后每7 d采集血液分离血清,采用间接ELISA方法和病毒中和试验测定并比较4组新西兰白兔特异性抗体和中和抗体的水平。【结果】经DNAStar分析,NP蛋白第193-368位氨基酸处的平均抗原指数在0.4~1.7之间,亲水指数为0~1.5,证明该区域抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到NP基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致;SDS-PAGE结果显示,NP蛋白表达量较高,蛋白分子质量为50 ku且以包涵体形式表达;Western blotting结果表明,所表达的蛋白具有较强的反应原性;ELISA结果显示,在免疫后28 d,对照组的特异性抗体效价为0,灭活疫苗组、NP蛋白组及灭活疫苗和NP蛋白混合组的特异性抗体效价分别达到1∶2^(11)、1∶2^(17)和1∶2^(18)。病毒中和试验结果显示,在免疫后28 d,对照组中和抗体效价为0,灭活疫苗组、NP蛋白组及灭活疫苗和NP蛋白混合组的中和抗体效价分别为1∶2^(3.32)、1∶2^(4.48)和1∶2^(4.98)。【结论】BPIV3 NP蛋白可增强BPIV3灭活疫苗的免疫效果,在灭活疫苗中加入NP蛋白可作为BPIV3灭活疫苗的新型接种方法。

牛病毒性腹泻病毒对新西兰白兔致病性分析及E2蛋白免疫效果的评价

【目的】研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对新西兰白兔的致病性以及BVDV E2重组蛋白的免疫效果。【方法】将实验室培养保存的BVDV病毒纯化并按照Reed-Muench法测定其病毒滴度。在致病性试验中,将10只新西兰白兔随机分为感染组和对照组,每组5只。感染组用1 mL纯化的BVDV病毒攻毒(滴鼻500μL、耳缘静脉注射500μL),对照组用等体积的生理盐水处理,连续3 d,每天1次,每天观察各组兔的临床症状并测量体温;分别于接种病毒后第6、9、12、15、17天通过耳缘静脉采集血液检测血常规;感染病毒第17天采集鼻拭子进行RT-PCR鉴定,采集后剖杀并采集气管、肺脏、脾脏和小肠组织,制备病理切片观察病理变化。在免疫效果评价试验中,将10只新西兰白兔随机分为免疫组和对照组,每组5只,免疫组用E2重组蛋白(1 mg/只)与佐剂混合后经肌内多点注射免疫新西兰白兔,对照组接种等体积生理盐水;共免疫2次,2次免疫间隔为14 d。在一免后0、7、14、21、28 d采集血清,通过间接ELISA方法检测血清中抗重组蛋白特异性抗体水平;在一免后第28天按致病性试验中方法攻毒,在攻毒第17天采集鼻拭子进行RT-PCR鉴定,采集气管、肺脏、脾脏和小肠组织制备病理切片观察病理变化及免疫组织化学检测。【结果】纯化后BVDV的病毒滴度为4.16×10~6 TCID/mL。与对照组相比,感染组部分新西兰白兔6 d内活动减少,采食略微减少,6 d后逐渐恢复正常,在感染第13天出现腹泻症状,从第5天开始体温略微升高,但均在正常范围内波动。与对照组相比,在攻毒第6和9天,感染组白细胞和血小板分别显著和极显著降低(P<0.05;P<0.01);在攻毒第12、15和17天,感染组白细胞、血小板和淋巴细胞均极显著降低(P<0.01)。鼻拭子RT-PCR检测为阳性,气管、肺脏、脾脏及小肠组织表现出轻度至重度的组织病理学变化。间接ELISA检测结果表明,在一免后7 d时,血清抗体滴度为1∶16~1∶32;在一免后28 d时,血清抗体滴度为1∶256~1∶512;免疫攻毒组新西兰白兔鼻拭子经RT-PCR检测为阴性;组织病理学观察显示,免疫攻毒组气管及肺脏表现出轻微的组织病理学变化。免疫组化检测结果显示,免疫组结果均呈阴性,对照组结果均为阳性。【结论】通过滴鼻及耳缘静脉注射BVDV的方式可以构建新西兰白兔致病模型,BVDV E2亚单位疫苗能够刺激机体产生特异性抗体,起到免疫防御的作用。

抗体检测胶体金免疫层析技术中不同拦截模式的初步比较研究

胶体金免疫层析技术是以胶体金作为示踪标志物,应用于抗原抗体反应中的一种新型快速检测技术,目前国内外对于抗体检测胶体金免疫层析技术中不同拦截模式的比较研究较少。本研究将牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)的gD基因进行了原核表达,以纯化的IBRV gD-pAb作为检测靶标,将胶体金标记的g D蛋白、金黄色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)、链球菌蛋白G(streptococcal protein G,SPG)、羊抗兔IgG分别包被于金垫,将未标记的上述4种蛋白分别包被于NC膜的检测线处,将金垫和NC膜进行组合,制备出7种抗体拦截模式的胶体金免疫层析试纸,通过比较其灵敏度、显色效果及批内重复性来评价不同拦截模式的实际性能。结果显示,标记抗原-SPG、标记抗原-SPA、标记抗原-二抗拦截模式(间接法)的灵敏度约为标记抗原-抗原拦截模式(双抗原夹心法)的200倍;间接法中标记抗原-SPG、标记抗原-SPA与标记SPG-抗原、标记二抗-抗原拦截模式的灵敏度相近,而标记抗原-二抗拦截模式及标记SPA-抗原拦截模式由于IgG结合蛋白的特性而导致试纸的灵敏度降低、显色效果及批内重复性变差;7种抗体拦截模式试纸在检测副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)、赤羽病病毒(akabane virus,AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛支原体(Mycoplasma bovis)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的标准阳性血清时均为阴性反应;IgG结合蛋白的实际性能排序为SPG>SPA>二抗。本研究为其他疫病抗体检测的胶体金免疫层析试纸的制备提供参考。

牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸的研制

将gD蛋白用胶体金标记并包被于结合垫作为检测探针,未标记的gD蛋白包被NC膜作为检测线,以金标记鼠IgG与羊抗鼠IgG作为独立质控系统,利用双抗原夹心法建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)抗体的胶体金免疫层析试纸,并对该试纸进行了性能评价。结果显示,该试纸在检测副结核分枝杆菌(MAP)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛支原体(M.bovis)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、口蹄疫病毒(FMDV)的标准阳性血清时均为阴性反应;该试纸在检测IBRV标准阳性血清时敏感性为1∶16;将该试纸与进口商品化ELISA试剂盒共同检测60份待检牛血清,两者的阳性符合率为93.3%,阴性符合率为100%,总符合率为96.7%。结果表明,本试验建立的胶体金免疫层析试纸可在10~15 min完成检测,具有快速、准确、简便等特点,为临床定性检测及现场诊断牛传染性鼻气管炎提供了有效工具。

四种分子伴侣促进牛支原体膜蛋白在大肠杆菌中可溶性表达研究

为研究分子伴侣是否可以促进牛支原体膜蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达及表达的蛋白是否具有活性,应用原核表达和Western blot方法进行检测,结果表明:1)牛支原体一个膜蛋白M1的截短片段在大肠杆菌表达系统中以包涵体形式表达,改变诱导时间、温度以及诱导剂浓度均未改变其表达形式;2)将4种分子伴侣pGKJE8、pGro7、pG-Tf2和pTf16分别与含有目的蛋白的重组质粒在表达工程菌(BL21)中共表达,当加入终浓度为1.0mmol/L IPTG以及0.5mg/mL L-阿拉伯糖或5.0ng/mL四环素的诱导剂,37℃诱导5h,发现分子伴侣pGTf2和pG-KJE8能显著提高M1截短片段的可溶性表达,其他2种分子伴侣未改变M1的表达形式;3)可溶性表达的M1截短片段与牛支原体阳性血清可以发生特异性反应。因此,研究发现2种分子伴侣可以使牛支原体膜蛋白在大肠杆菌表达系统中以可溶性形式表达,但未改变其生物活性,该研究结果可为建立牛支原体有效的血清学诊断方法及亚单位疫苗的研制奠定基础。

IBRV gD蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

利用生物学软件分析牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白的抗原决定簇,发现相应的核酸序列,设计特异性引物用PCR扩增IBRVgD基因片段并克隆到原核表达载体pET-32a中,通过双酶切鉴定正确和测序正确后进行诱导表达。利用间接ELISA方法和Western blot鉴定gD重组蛋白的免疫原性和反应原性。最后将gD重组蛋白用作包被抗原,并通过优化相应的反应条件建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的gD重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,间接ELISA阴阳性临界值为:D450nm值=0.23。重组抗原gD与口蹄疫、牛病毒性腹泻、赤羽病、副结核病、布鲁菌病、结核病等阳性血清无交叉反应,具有比较好的特异性。组内和组间变异系数均小于5%,重复性较好。建立的ELISA方法结果显示,当测试相同的200个临床血清样本时,与IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒gB X3抗体检测试剂盒相比,两者符合率为96%。本试验为IBRV抗体间接ELISA检测试剂盒的开发奠定了基础。

中国奶牛牛支原体流行病学调查分析

为调查中国奶牛养殖地区牛支原体(Mycoplasma bovis)的流行情况,从2013—2019年,在中国6个奶牛养殖区域集约化牧场,通过随机采样收集犊牛鼻拭子1878份,对样品进行M.bovis分离鉴定,并分析M.bovis阳性率时间分布,空间分布以及犊牛日龄与M.bovis阳性率的关系。结果表明:1)空间上,中国不同奶牛养殖地区,M.bovis阳性率是不同的。其中西北区(38.7%)高于华东区(35.6%)、华北区(33.6%)、华中区(30.8%)、华南区(29.9%)和西南区(27.1%)。2)时间上,2013—2015年M.bovis阳性率平均值为47.9%,三年间M.bovis阳性率差异不显著(P>0.05)。2016—2019年,M.bovis阳性率平均值为21.1%,四年间M.bovis阳性率无显著性差异。2013—2015年M.bovis阳性率显著高于2016—2019年M.bovis阳性率(P<0.05)。3)季节上,夏秋季节M.bovis平均阳性率为31.3%,冬春季节M.bovis阳性率平均值为33.9%,不同季节M.bovis阳性率差异不显著(P>0.05)。4)通过线性回归分析,表明M.bovis阳性率与犊牛日龄呈正相关。综上,2013—2019年,中国奶牛养殖地区M.bovis阳性率平均值为32.6%,M.bovis在中国呈长期流行趋势。季节并不影响M.bovis在犊牛中的流行。M.bovis阳性率与犊牛日龄呈线性正相关。本研究丰富了中国奶牛养殖地区牛支原体流行情况数据,从病原学角度为预防和临床用药提供重要的数据支撑。

基于转录组测序结果对绵羊肺炎支原体培养基优化的初步研究

通过对绵羊肺炎支原体（M ycoplasm a ovipneum oniae,Mo）N M-151分离株进行转录组测序（RNAseq）,基于转录组数据分析的基础上提出培养基优化方案,以解决Mo培养难的问题。收集NM-151分离株对数期、稳定期和衰亡期三个生长时期的样品进行RNA-seq,通过基因表达水平和K EG G pathway富集分析,提出培养基的优化方案,并进行培养试验验证,复苏并稳定传代的菌株以1∶20分别接种于4种培养基中培养监测240 h,每隔12 h取样,利用颜色变化单位（CCU）、菌落形成单位（CFU）、pH值和D630值绘制生长曲线。结果表明,嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）和嘧啶核苷磷酸化酶（Py NPase）表达水平随生长时间的推移均呈下调趋势,但PNPase表达量远高于Py NPase表达量（P〈0.01）;在普通培养基中,添加丝氨酸对Mo的生长没有明显作用（P〉0.05）;添加20 mmol/L HEPES能够在一定程度上延长Mo的稳定期并提高菌数（P〉0.05）;同时添加两者的改良培养基能够明显延长Mo的稳定期,240 h仍处于稳定期未进入衰亡期,且菌数由108提高到109CFU/m L（P〈0.01）。证实改良培养基能够明显延长Mo的生长周期并在菌数上提高一个数量级。