哮喘患儿外周血树突状细胞共刺激分子表达研究

目的 探讨小儿哮喘发作时外周血树突状细胞 (DC)表面协同刺激分子CD4 0、CD80、CD86和HLA DR的表达 ,以及其激发同种异体T淋巴细胞和脐带血幼稚T淋巴细胞 (Na veTcells)的作用 ,为进一步研究小儿哮喘的发病机制及治疗提供新的思路。方法 以Thomas法分离、培养并诱导哮喘患儿和健康儿童外周血DC细胞 ,流式细胞仪 (fluorescentactivatedcellsorter,FACS)检测DC表面协同刺激分子CD4 0、CD80、CD86和HLA DR的表达 ,以及其激发同种异体T淋巴细胞和脐带血幼稚T淋巴细胞的作用。结果 哮喘患儿外周血DC表面CD86和HLA DR的表达较对照组明显升高 (t分别 =3 .3 0 4、9.4 81;P分别 <0 .0 1、0 .0 0 1) ,而CD4 0则显著降低 (t=5 .65 9,P <0 .0 0 1) ;其激发同种异体T淋巴细胞和脐带血幼稚T淋巴细胞的能力较对照组明显增强 (P <0 .0 1～ 0 .0 0 1)。结论 哮喘患儿可通过其DC表面差异表达CD4 0、CD86和HLA DR等协同刺激分子 ,从而使其激发T淋巴细胞的作用增强。所以DC在小儿哮喘发作时起重要作用。

IL-11基因修饰的基质细胞对造血细胞体外扩增的影响

目的 研究造血因子白介素 11(IL 11)基因修饰的基质细胞对造血细胞体外扩增的影响。方法 采用逆转录病毒载体将IL 11基因转入基质细胞HFCL ,用Northernblot检测基质细胞HFCLIL 11基因的表达 ,用流式细胞仪检测IL 11基因修饰的HFCL支持的脐血CD3 4 + 造血细胞体外扩增中表型为CD3 4 + CD3 8- 早期祖细胞和表型为CD3 4 + CD41+ 巨核系定向祖细胞的比例。结果 基质细胞HFCL能够表达逆转录病毒介导的IL 11基因 ,并且在这种IL 11基因修饰的基质细胞支持下 ,脐血CD3 4 + 造血细胞经过7d扩增 ,扩增细胞中表型为CD3 4 + CD3 8- 的早期祖细胞和表型为CD3 4 + CD41+ 巨核系祖细胞的比例分别为 (1.62± 0 .2 3 ) %、(9.9±1.1) % ,高于未转基因HFCL的 (0 .8± 0 .2 3 ) %、(6.5± 1.8) % ,而在相同条件下细胞因子支持的扩增细胞中则分别为 (0 .19±0 .14 ) %、(6.0± 1.1) %。结论 基质细胞能够表达经逆转录病毒载体介导的IL 11基因 ,而且经IL 11基因修饰的基质细胞能显著促进CD3 4 + CD3 8- 的早期祖细胞和CD3 4 + CD41+ 巨核系祖细胞扩增。

细胞因子在特发性血小板减少性紫癜发病机理中作用的研究

对26例ITP患儿白细胞介素-2（IL-2）、B细胞生长因子（BCGFs）、白细胞介素-6（IL-6）活性水平进行了检测。结果表明:与正常对照组比较,ITP患儿IL-2和BCGFs活性水平明显增高,IL-6活性水平与正常对照无差别;ITP患儿IL-2和BCGFs均与B细胞分泌IgG和PAIgG相关。结果提示:IL-2和BCGFs活性水平异常可能在ITP免疫紊乱中具有一定作用。

小儿特发性血小板减少性紫裥抗血小板抗体亚类的研究

采用鼠抗人IgG亚类单克隆抗体酶联免疫吸附法对急、慢性ITP患儿进行血小板表面相关IgG(PAIgG)亚类及血清IgG亚类测定。结果表明:ITP患儿抗血小板抗体有IgG亚类限制性,主要以PAIgG_1和PAIgG_3增高为主。其原因可能与某些感染及免疫调节异常有关。血清IgG亚类缺陷可能是ITP病因之一。PAIgG亚类在诊断和判断疗效中起重要作用。

胚胎干细胞及其在移植治疗中的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)因具有多向分化潜能及能在体外不断被扩增的特点,自发现起就受到生命科学领域关注。本文综述了胚胎于细胞的来源,生物学特性,在细胞、组织和器官移植中的应用及人Es应用研究中所面临的问题。

IL—4基因修饰逆转肝癌细胞多药耐药

目的 探讨IL—4基因修饰对肝细胞癌多药耐药(MDR)的逆转作用及可能机制。方法 用逆录病毒载体将IL—4基因导入人肝癌细胞细胞系HepG2,采用MTT生物活性法检测药物敏感性。间接免疫荧光染色流式细胞仪分析P—糖蛋白(P—gP)。微量荧光分光光度法分析癌细胞内ADM聚集量。结果 IL—4基因修饰显著提高癌细胞对多种化疗药物的敏感性(耐药逆转倍数在6～32倍间)及增加ADM在癌细胞内聚集;P—gP阳性表达率(5％±0.6％)较野生型及空载体修饰细胞(98.5％+0.5％)明显降低。逆转作用可为PKC激活剂TPA所阻断。IL—4基因修饰瘤苗及其培养上清与野生型细胞共培养,也可使野生型瘤细胞产生逆转效应。结论 IL—4基因修饰可通过自分泌、旁分泌形式逆转肝癌细胞MDR,此作用可能与其下调P—gP表达及抑制PKC活性有关。

特发性血小板减少性紫癜免疫紊乱及细胞因子

目前虽已公认特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一自身免疫病,但其具体发病机制十分复杂,病理生理机制尚不完全清楚。近年来随着对ITP免疫紊乱和细胞因子尤其是IL-2、IL-4、IL-6对免疫紊乱和造血调控研究的不断深入,已获得许多有关的线索,本文仅就此作一综述。

特发性血小板减少性紫癜骨髓中小巨核细胞和变性巨核细胞观察及其临床意义探讨

本文研究了30例ITP患儿骨髓中SMK和DMK的数量及其形态变化。结果表明：有SMK及DMK者占77％（23/30）（SMK5例、DMK4例，二者均有14例）。其中63％（19/30）有SMK，占MK数的2～42％；60％（18/30）有DMK、占MK的2～10％。本文结合临床表现及随访资料对SMK及DMK与ITP的临床及预后的关系做了探讨。

ITP患儿的白细胞介素2受体及NK细胞的研究

采用双抗夹心ELISA、APAAP桥联酶标法、MTT比色法检测了34例ITP患儿的血清可溶性白介素2受体（sIL-2R）外周血单个核细胞（PBMC）经PHA刺激后膜白介素2受体（mIL－2R）的表达、T淋巴细胞亚群以及自然杀伤（NK）细胞活性。结果：ITP患儿血清sIL－2R水平升高，mIL－2R的表达和NK活性显著降低；血清sIL－2R水平与NK活性、CD4+／CD8+比值是负相关，与疾病严重程度和疗效密切相关。提示sIL－2R可作为监测病情、观察疗效的敏感指标；在纠正ITP的免疫调节紊乱中应充分考虑到细胞因子受体异常这个环节。

核转录因子在细胞因子介导的川崎病血管内皮损伤中的作用机理

目的 探讨核转录因子 (NF κB)在诱导川崎病炎性细胞因子及血管内皮细胞损伤中的作用及机理。方法 建立人脐静脉内皮细胞培养模型 ,酶联免疫吸附实验 (ELISA)双抗体夹心法检测川崎病患儿外周血单个核细胞 (PBMC)活化后培养上清液白细胞介素 6 (IL 6 )、白细胞介素 1β(IL 1β)、肿瘤坏死因子α(TNF α)的分泌量 ;采用AnnexinⅤ /PI双染色法 ,流式细胞仪检测川崎病患儿PBMC培养上清液所诱导的内皮细胞凋亡率 ;凝胶电泳迁移率转换实验 (EMSA)检测所活化PBMC核因子NF κB的活性。结果 川崎病组患儿PBMC体外经刺激后IL 6、IL 1β、TNF α等炎性细胞因子的分泌均明显高于正常对照组 (P <0 0 1) ,其培养上清液所诱导的内皮细胞凋亡率 [(38 4± 7 8) %]则较正常对照组 [(2 8± 0 8) %]明显升高。分别加入足量白细胞介素 6单克隆抗体 (IL 6McAb)、肿瘤坏死因子α单克隆抗体 (TNF αMcAb)、白细胞介素 1β受体a(IL 1ra)或联合加入上述阻断剂于川崎病患儿PBMC培养上清液中 ,可不同程度地逆转川崎病患儿PBMC培养上清液所诱导内皮细胞的凋亡。川崎病患儿PBMC刺激活化后NF κB活性显著增高。NF κB抑制剂SN50 明显抑制川崎病患儿PBMC上述细胞因子的分泌 。

白细胞介素-10在川崎病炎性细胞因子介导的血管损伤中的作用初探

目的 探讨白细胞介素 10 (IL 10 )在炎性细胞因子介导的川崎病血管内皮损伤中的作用及机制。方法 建立人脐静脉内皮细胞培养模型 ,ELISA双抗体夹心法检测川崎病患儿外周血单个核细胞 (PBMC)活化后培养上清IL 6、IL 1β、肿瘤坏死因子 α(TNF α)、IL 10的分泌量 ;AnnexinV/PI双染色法 ,流式细胞仪检测川崎病患儿PBMC培养上清所诱导的内皮细胞凋亡率 ;凝胶电泳迁移率转换实验 (EMSA)检测所活化PBMC核因子NF κB活性。结果 川崎病组患者PBMC体外刺激活化后IL 6、IL 1β、TNF α等炎性细胞因子及IL 10的分泌量均明显高于正常对照组 (P <0 0 1) ,其培养上清所诱导内皮细胞凋亡率 (38 4± 7 8) %较正常组 (2 8± 0 8) %明显升高。抗IL 6、TNF αMcAb、IL 1ra加入川崎病患儿PBMC培养上清 ,可不同程度抑制川崎病患儿PBMC培养上清所诱导内皮细胞的凋亡 ,而抗IL 10McAb加入川崎病患儿PBMC培养上清所诱导内皮细胞的凋亡细胞反而增多 ,凋亡细胞的百分率高达 (5 8 6± 14 6 ) %。川崎病患儿PBMC刺激活化后核因子NF κB活性显著增高。于PBMC培养上清加入IL 10 ,可见伴随着IL 6、IL 1β、TNF α等炎性细胞因子在PBMC中的表达降低 ,NF κB活性也降低 ,同时内皮细胞凋亡明显减少。结论 IL 10抑制川崎病患儿免疫?

树突状细胞在小儿哮喘发病机制中的作用

目的 探讨树突状细胞 (DC)在小儿哮喘发病中的可能作用及机制。方法 以Thomas法 ,采用粒 巨噬细胞集落刺激因子 ,白细胞介素 4 (IL 4 )和肿瘤坏死因子α(TNF α)联合培养诱导哮喘患儿外周血DC细胞 ,进而检测DC协同刺激分子B7 1(CD80 )、B7 2 (CD86)的表达 ,DC诱导自体T淋巴细胞的增殖反应 ,以及其分泌的IL 10、IL 12等水平的变化。结果 哮喘患儿外周血DC诱导自体T淋巴细胞增殖反应明显高于对照组 (cpm值分别为 115 6 0± 12 6和 6 5 39± 12 6 ,t =12 1 6 96 ) ,差异有非常显著意义 (P <0 0 1) ;其分泌IL 10水平 [( 3 6± 0 3) μg/L]明显低于对照组 [( 6 9± 0 8) μg/L],差异有非常显著意义 (t=2 0 6 0 8,P <0 0 1) ;分泌IL 12水平 [( 2 9 7± 8 4 )ng/L]也明显低于对照组 [( 4 5 2± 9 8)ng/L],差异有非常显著意义 (t=5 979,P <0 0 1) ;同时 ,哮喘患儿外周血人类白细胞抗原DR( 19 9± 1 3)和协同刺激分子B7 2 (CD86)的表达水平 ( 36 3± 14 0 )明显高于对照组( 10 6± 1 5和 2 4 7± 8 5 ) ,差异有非常显著意义 (t分别 =2 3 30 1和 3 314 ,P均 <0 0 1)。结论 DC可能通过诱导TH1/TH2细胞分化在小儿哮喘发作时起重要作用。其可能的机制系通过DC分泌的细胞因子而起作用。

Tpo、IL-11基因修饰的基质细胞对CD_(34)^+CD_(38)^-早期造血祖细胞扩增的影响

目的 观察经Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞对脐血CD3 4 + CD3 8-细胞体外扩增的影响。方法 用载有Tpo、IL 11基因的重组逆转录病毒感染成纤维样基质细胞HFCL ,通过Northernblot法检测基因修饰的HFCL细胞Tpo、IL 11基因的表达。以未经基因修饰的HFCL细胞作为对照 ,将脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞在这种基因修饰的HFCL细胞支持下 ,进行 7d体外扩增后 ,用锥虫蓝拒染法计数活细胞总数 ,并用流式细胞仪分析扩增细胞中CD3 4 + 细胞以及CD3 4 + CD3 8-细胞的比例。结果 在Tpo基因修饰的HFCL细胞、IL 11基因修饰的HFCL细胞和Tpo +IL 11基因共同修饰的HFCL细胞的支持下 ,扩增后CD3 4 + CD3 8-早期造血祖细胞的比例分别为 (1.8± 0 .2 4 ) %、(1.6 2± 0 .2 3) %、(2 .4 5±0 2 8) % ,细胞扩增倍数为 4 .2倍、3.6倍、6 .9倍 ,高于对照组的 (0 .80± 0 .2 3) %和 1.5倍 ,同时扩增细胞总数和CD3 4 + 细胞比例亦高于未经基因修饰的HFCL细胞所支持的扩增体系。结论 Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞可有效促进脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞体外扩增 ,同时能有效维持扩增体系中的CD3 4 + CD3 8-细胞以及促进其扩增。

人IL-4基因修饰诱导肝母细胞瘤细胞凋亡及分化的研究

目的 研究人白细胞介素 4(IL 4)基因修饰对肝母细胞瘤细胞凋亡及分化的影响及可能机制。方法 以逆转录病毒为载体将人IL 4基因导入人肝母细胞瘤细胞系 (HepG2 )细胞。台盼蓝拒染、瑞氏染色、放射免疫测定、流式细胞仪细胞周期分析、原位杂交等方法检测人IL 4基因修饰后细胞形态、甲胎蛋白合成以及原癌基因c fos、c jun、c myc表达的变化。流式细胞仪AnnexinⅤ /PI双染色法及间接免疫荧光染色法检测凋亡细胞及凋亡调控基因p5 3、bcl 2的蛋白表达。结果 (1)人IL 4基因修饰较空载体修饰及野生型HepG2细胞的细胞周期发生G0 /G1期阻滞 ,甲胎蛋白分泌量及原癌基因c fos、c jun、c myc表达降低 (P <0 .0 0 1)。细胞在形态及功能上趋向正常肝细胞转化 ;(2 )较空载体修饰及野生型HepG2细胞 ,IL 4基因修饰后部分细胞形态上出现核固缩等典型凋亡细胞的特征 ,流式细胞仪亦检测到 18.5 %± 4.7%的凋亡细胞 ;(3)人IL 4基因修饰增加p5 3而抑制bcl 2表达 (P <0 .0 5 )。结论 人IL 4基因修饰可诱导肝母细胞的凋亡及分化 ,诱导凋亡细胞可能与上调p5 3蛋白及抑制bcl 2蛋白表达有关。

白介素-4基因修饰对儿童肝母细胞瘤多药耐药的逆转及其机制研究

目的 探讨白介素 4 (IL 4 )基因修饰对儿童实体瘤多药耐药 (MDR)的逆转作用及可能机制。方法 用逆转录病毒载体将人IL 4基因导入人肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,采用MTT生物活性法检测瘤细胞对化疗药物的敏感性。间接免疫荧光分光光度分析瘤细胞P 糖蛋白 (P gp)的表达率。微量荧光分光光度法分析瘤细胞内阿霉素 (ADM)聚集量。结果 IL 4基因修饰显著降低瘤细胞对种化疗药物的半数抑制浓度 (IC5 0 ) ,表现出MDR逆转效应 (耐药逆转倍数在 6～ 32倍数间 )及明显增加化疗药物在瘤细胞内聚集 ,同时IL 4基因修饰瘤细胞P gp阳性表达率 (5± 0 6 % )较野生型及空载体修饰细胞 (98 5± 0 5 %、97 0± 1 0 % )明显减低。IL 4基因修饰对瘤细胞的MDR逆转作用可为PKC激活剂TPA所阻断。IL 4基因修饰瘤苗及其培养上清与野生型细胞共培养 ,也可使野生型瘤细胞产生MDR逆转效应。结论 IL 4基因修饰瘤苗可通过自分泌、旁分泌形式逆转瘤细胞MDR ,此作用可能与其抑制PKC活性及下调P

白细胞介素4诱导人肝母细胞瘤系细胞分化的实验研究

目的 研究人白细胞介素 4(IL 4)对肝母细胞瘤细胞系 (HepG2 )分化诱导作用及诱导分化过程中端粒酶活性的变化及可能机制。方法 用锥虫蓝拒染活细胞染色法、流式细胞仪细胞周期分析、瑞氏染色形态学检测、放射免疫测定、原位杂交等方法检测IL 4处理前、后细胞的增殖、形态、甲胎球蛋白合成及原癌基因c fos、c myc表达情况。聚合酶链反应结合酶联免疫吸附实验 (PCR ELISA)半定量检测瘤细胞端粒酶活性。用无血清培养使细胞周期同步于静止期 (G0 G1 )的方法 ,探讨端粒酶在瘤细胞被诱导分化过程中的活性变化与细胞周期时相的关系。结果 IL 4处理后HepG2 细胞生长速度减慢 (n =10 ,F =16 .7,P <0 .0 5 ) ,c fos和c myc基因表达积分从 (2 79± 2 1) %、(2 10±39) %降至 (38± 8) %及 (16± 5 ) % (n =10 ,t值分别为 13 6、8 4,P均 <0 .0 1)。G0 G1 细胞由 (4 5 .4± 2 .7) %增至 (5 7.8± 3 .3) % (n =10 ,t=4.2 ,P <0 .0 5 ) ;细胞形态趋向正常肝细胞形态转化 ;2 4h每 10 6个肿瘤细胞甲胎球蛋白分泌量从 (15 .6± 0 .7)ng降至 (4 .5± 1.2 )ng(n =10 ,t=9.8,P <0 .0 5 )。同时还发现IL 4处理后 48h端粒酶活性即见明显下降 ,A值 (代表端粒酶活性 )即由处理前的 1.2降至0 .7(t=8.4,P <0 .0 1) 。

TPO基因修饰的基质细胞对巨核系细胞的定向扩增作用

目的 研究TPO基因修饰的基质细胞对CD34+ 造血细胞向巨核系细胞定向增殖分化的影响。方法 将TPOcDNA构建到pBabe pura中 ,通过“乒乓转染法”获得产高滴度逆转录病毒载体的包装细胞 ;利用所获的病毒上清转染基质细胞HFCL ,用Northernblot检测细胞中TPO基因的表达 ,并利用TPO依赖株检测上清中的TPO活性 ;以未转基因的HFCL为对照 ,将CD34+ 造血细胞在TPO基因修饰的HFCL支持下扩增 ,用流式细胞仪检测扩增细胞中表型为CD34+ CD41+ 和表型为CD41+ CD6 1+ 细胞的比例。结果 基质细胞HFCL能够有效表达外源性TPO基因 ,在HFCL TPO培养上清中有 0 75ng ml水平的TPO活性 ;并且在HFCL TPO支持下 ,CD34+ 造血细胞经过 7d扩增后 ,CD34+ CD41+ 细胞的比例为 (13 7± 2 0 ) % ,HFCL为 (6 5± 1 8) % (P <0 0 1) ;CD41+ CD6 1+ 细胞的比例为 (11 9± 0 7) % ,略高于HFCL的 (10 6± 1 5 ) % (P >0 0 5 )。结论 基质细胞能够有效表达外源性TPO基因和其蛋白 ,而且TPO基因修饰的基质细胞能显著促进CD34+ CD41+ 巨核祖细胞的扩增 ,但对较成熟的CD41+ CD6 1+

造血因子基因修饰的基质细胞诱导造血细胞向巨核系细胞定向扩增的研究

目的 为诱导造血细胞在体外向巨核系细胞定向扩增 ,观察了促血小板生成素 (TPO)、白细胞介素 11(IL 11)基因修饰的成纤维样基质细胞 (HFCL)对纯化的脐血CD+34 造血细胞向巨核系细胞定向增殖分化的影响。方法 以未经造血因子修饰的HFCL支持的造血细胞体外扩增作为对照 ,采用流式细胞仪检测脐血CD+34 造血细胞在TPO基因修饰的HFCL(TPO/HFCL)、IL 11基因修饰的HFCL(IL 11/HFCL)以及TPO和IL 11基因共修饰的HFCL(TPO +IL 11/HFCL)的支持下 ,经过 7d的体外扩增后 ,扩增细胞中的CD+34 CD+4 1巨核系祖细胞和表型为CD+4 1CD+61较成熟的巨核系细胞的比例。结果 脐血CD+34 造血细胞经过 7d体外扩增后 ,CD+34 CD+4 1巨核系祖细胞在TPO/HFCL、IL 11/HFCL和TPO +IL11/HFCL支持的扩增细胞中的比例分别为 (13.7± 2 .0 ) %、(9.9± 1.1) %、(14.5± 2 .0 ) % ,高于HFCL的 (6 .5± 1.8) % (P <0 .0 1) ;并表现为TPO/HFCL支持的扩增细胞中巨核系祖细胞的比例高于IL 11/HFCL(P <0 .0 5 )。而表型为CD+4 1CD+61的巨核系细胞在扩增细胞中的比例分别为 (11.9±0 .7) %、(2 4.1± 3 .1) %、(17.6± 1.9) % ,其中IL 11/HFCL和TPO +IL 11/HFCL支持的扩增体系高于HFCL的 (10 .6± 1.5 ) % (P <0 .0 1) ;且IL 11/HFCL对CD+4