基于非靶向代谢组学的儿童川崎病血浆生物标志物筛选研究

目的通过非靶向代谢组学方法探究川崎病(KD)儿童血浆中代谢物的变化。方法采用病例对照研究,选用2021年5月到2022年5月在南通大学附属常州儿童医院风湿免疫科确诊为KD的22例患儿为病例组,并以同期21例健康体检儿童作为对照组,采集入组儿童的血浆样本进行基于HPLC-MS/MS系统四极杆-静电场轨道阱Orbitrap质谱仪的代谢组学检测,并以正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)进行建模,以模型的VIP值>1和t-test比较中P<0.05作为标准筛选KD儿童血浆样本中的特异性差异代谢物;并选用KEGG数据库对差异代谢物进行注解,用MetaboAnalyst软件对其进行富集分析和拓扑分析,以筛选KD儿童血浆中涉及的关键差异代谢通路。结果代谢组学分析结果表明:①OPLS-DA模型中,KD组和正常组儿童血浆代谢轮廓存在显著差异,组间存在393种差异表达的代谢物,上调的代谢物包括1-甲基腺苷(+85%)、二脂酰甘油基三甲基高丝氨酸(3∶0/20∶4)(+2234%)、嘌呤(+220%)等,下调的代谢物包括溶血磷脂酰胆碱(P-16∶0)(-71%)、异羟脱氧胆酸(-79%)等;②MetaboAnalyst结果显示,鞘脂代谢、咖啡因代谢和酪氨酸代谢通路是KD病理状态中改变最显著的差异代谢通路。结论KD病理状态可造成血浆代谢物谱的显著变化;鞘脂代谢、咖啡因代谢和酪氨酸代谢是改变最显著的差异代谢通路,提示KD会系统性地扰动患儿的生理代谢活动,本文从代谢组学角度较系统地揭示了KD儿童和健康儿童的差异代谢物和代谢通路,为KD的早期诊疗和对应的药物开发提供参考。

CPT1A基因外显子纯合缺失变异导致的肉碱棕榈酰转移酶1A缺乏症1例

肉碱棕榈酰转移酶1A(carnitine palmitoyltrans-ferase 1A,CPT1A)缺乏症(OMIM#255120)是一种长链脂肪酸氧化障碍的常染色体隐性遗传疾病,由CPT1A基因(OMIM#600528)变异导致。CPT1A是长链脂肪酸进入线粒体进行β氧化的限速酶。当CPT1A缺乏症患者长期禁食或处于病理状态时,糖原贮备不足,肝脏线粒体脂肪酸β氧化提供能量被抑制,出现低血糖、肝性脑病等多系统症状[1]。该疾病罕见,到目前为止,人类基因组突变数据库(Human Genome Mutation Database,HGMD)仅收录了41种突变(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=CPT1A),多为点突变,本文首次报道了中国人群中1例外显子4~5纯合缺失的变异类型,丰富了该基因变异谱,并结合qPCR进行了验证。

55例肝豆状核变性患儿表型与基因型分析

目的:了解肝豆状核变性(Wilson disease,WD)患儿的临床表型与 ATP7B基因突变谱。 方法:以2012年6月至2018年6月期间在南京医科大学附属儿童医院确诊为WD的55例患儿为研究对象,采用PCR扩增后直接测序法检测 ATP7B基因点突变,测序仅发现杂合突变患儿;进一步采用多重连接依赖的探针扩增法(MLPA)进行外显子长片段突变分析。 结果:55例WD患儿均有不同程度的肝损害症状,其中2例合并神经系统症状。K-F环阳性率(21%)、24小时尿铜阳性率(97.7%)、铜蓝蛋白均异常。55例患者中 ATP7B基因鉴定结果:纯合子8例,复合杂合子41例和杂合子6例。直接测序法检测到10例 ATP7B基因杂合子,进一步采用MLPA分析发现,其中4例患者另一个等位基因携带 ATP7B基因外显子缺失。在所有患者中,共检测到35种不同的 ATP7B基因突变,包括23种错义突变,3种移码突变,4种无义突变,3种外显子缺失和2种剪接改变。最常见的等位基因突变为外显子8的c.2333G > T/p.R778L,等位基因频率为36.54%,其次是外显子13的c.2975C > T/p.P992L,等位基因频率为14.42%。 结论:ATP7B基因c.2333G > T/p.R778L和c.2975C > T/p.P992L变异为中国WD患儿中最常见的变异。WD患者中报道3种 ATP7B基因外显子大片段缺失变异,对于DNA测序为 ATP7B基因杂合子的WD患儿,建议进一步采用MLPA方法检测外显子缺失变异。

ATP7B基因同义变异通过影响外显子剪接增强子导致mRNA剪接异常

目的探讨ATP7B基因罕见同义变异对其前体mRNA剪接的影响。方法从ExAc数据库中筛选出人群等位基因频率<0.005的248种罕见同义变异,用Human Splicing Finder(HSF)软件分析其对于前体mRNA剪接的影响,进一步用ESE Finder 3.0软件预测其对于反式作用因子SR蛋白家族结合能力的影响。筛选出同时影响两种或以上SR蛋白结合的罕见同义变异,用体外迷你基因剪接报告系统进行验证。结果HSF分析提示有136种罕见同义变异可能破坏外显子剪接增强子(exonic splicing enhancer,ESE)的基序;ESE Finder 3.0分析提示其中19种会同时影响两种或以上SR蛋白的结合。体外迷你基因实验证实其中c.1620C>T(p.L540L)和c.3888C>T(p.A1296A)变异可导致相应外显子的剪接异常,分别造成第4外显子的完全跳跃以及使第18外显子的跳跃增加25%。结论同义变异可能通过各种途径影响前体mRNA的剪接,其中以破坏ESEs基序最为常见。本研究结果证实c.1620C>T(p.L540L)和c.3888C>T(p.A1296A)变异会对ATP7B基因的mRNA剪接产生影响,使相应的外显子发生跳跃,从而为携带者的基因诊断和遗传咨询提供了依据。