猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速检测方法,参照GenBank已发表序列,根据TGEV和PEDV的S蛋白基因结构各设计1套特异性通用引物,扩增目的带分别为426和583 bp。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,紫外光下于500 bp上、下各有一条电泳带,达到区分和鉴别目的。经优化确立最佳反应体系:引物、MgCl2和dNTP浓度分别为8、9和14μmol·L-1,退火温度54℃。该方法在捕获信息和复杂基因分析方面具有快速、敏感、特异、低成本等优点,可为TGEV和PEDV检测及TGE和PED流行病学调查等提供技术支持。

沙门菌HPI基因缺失株构建及其对鸡巨噬细胞吞噬能力的影响

为进一步探讨沙门菌的致病机制，研究构建了耶尔森强毒力岛（HPI）基因缺失沙门菌，并检测了HPI基因缺失沙门菌对鸡巨噬细胞吞噬能力的影响。应用PCR扩增沙门菌脚V同源的cat基因片段，借助pKD46质粒在HPI阳性沙门菌中表达Exo、Beta和Gam3种蛋白质，实现HPI全岛敲除。利用HW基因敲除体系建立沙门菌感染巨噬细胞模型，并检测其对巨噬细胞吞噬能力的影响。结果显示，同源重组测序为阳性；irp2、irp9及irp5PCR鉴定为阴性；HPI阳性沙门菌感染鸡巨噬细胞（M—HPI）后0～2h，其对刚果红染色酵母的吞噬能力显著低于HPI缺失沙门菌（M—AHPI）（P〈0．05），而2h以后尽管仍然保持以上变化，但未见统计学意义（P〉0．05）。研究成功建立了沙门菌月Ⅳ全基因敲除方法和沙门菌删基因缺失株，HPI基因缺失株沙门菌感染可损伤鸡巨噬细胞的吞噬能力。