基于单细胞RNA测序和空间转录组测序分析矽肺中巨噬细胞差异基因及其功能

[背景]单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)和空间转录组测序技术的兴起使得肺部疾病得以深入研究,但这两者在矽肺中的研究甚少。[目的]利用scRNA-seq联合空间转录组测序技术探索矽肺巨噬细胞中差异表达基因(DEGs)和潜在诊断基因。[方法]雄性C57BL/6小鼠(5~6周龄,22~30 g)随机分为4组,即生理盐水(NS)组7 d、NS组56 d、SiO_(2)组7 d及SiO_(2)组56 d,每组各1只。SiO_(2)组小鼠通过气管滴注SiO_(2)悬液(0.2 g·kg^(−1),50 mg·mL^(−1))构建矽肺模型,对照组小鼠给予相同体积NS,第7、56天分别摘取右肺用于scRNA-seq以及左肺用于空间转录组测序。利用主成分分析技术和均匀流形逼近和投影降维,捕获细胞群。应用R语言的Find Markers函数分析两组肺组织中巨噬细胞的DEGs变化,对相应的DEGs进行基因本体富集分析和京都基因与基因组百科全书信号通路分析,同时应用STRING及Cytoscape软件的CytoHubba插件进行蛋白相互作用网络分析,筛选出关键(Hub)基因。运用空间转录组测序探究Hub基因在肺组织切片上的原始位置以及在肺巨噬细胞中的映射。最后验证Hub基因在矽肺病患者肺组织和小鼠矽肺模型中表达水平的关联性以及运用受试者工作特征曲线验证Hub基因诊断效能。体外实验应用细胞活力检测技术,验证SiO_(2)刺激下小鼠巨噬细胞(RAW264.7)活力的变化。[结果]scRNA-seq显示共捕获并定义了20个细胞群。scRNA-seq和空间转录组测序结果显示,与NS组相比,在SiO_(2)组小鼠肺组织中观察到巨噬细胞数量增多且聚集在病灶区。共筛选出97个巨噬细胞DEGs,包括75个上调基因,主要富集于中性粒细胞的趋化和迁移、趋化因子受体结合、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、白介素-17信号通路等过程中;22个下调基因,主要富集于晚期内吞体、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路和酒精性肝病信号通路等过程中。共筛选出2个核心模块和3个Hub基因,包括Ccl2、Ccl7、Ptgs2,scRNA-seq显示与NS组相比,它们在SiO_(2)组的表达水平升高且聚集在新增的巨噬细胞中,空间转录组测序显示它们聚集在炎性伴有结节病灶区;CCL7、PTGS2在矽肺患者肺组织中表达量相较于健康者增高,受试者工作曲线下的面积分别为0.850和0.786。与0 h相比,SiO_(2)刺激下3 h、6 h、12 h RAW264.7细胞活力增强(P<0.05)。[结论]通过生物信息学筛选出了矽肺小鼠肺组织的3个Hub基因(Ccl2、Ccl7、Ptgs2)和2个潜在诊断基因(CCL7、PTGS2)可能是潜在的矽肺早期阶段的分子生物学标志物,对矽肺的发生发展和预后存在一定的影响。