沉默PDE4B对内毒素刺激的小胶质细胞内cAMP的影响

目的观察磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4,PDE4)4种亚型(A、B、C和D)的siRNA对内毒素刺激前后小胶质细胞内cAMP的影响。方法 24孔板接种原代培养的小胶质细胞,收集细胞测定PDE4 4种亚型的蛋白含量。随机将细胞分为空白对照组、LPS组、单纯载体组、错配siRNA组、PDE4A-siRNA组、PDE4B-siRNA组、PDE4C-siRNA组和PDE4D-siRNA组,空白对照组与LPS组细胞不进行转染;其余5组分别转染LipofectaminTMRNAiMAX、错配siRNA、PDE4A siRNA、PDE4B siRNA、PDE4C siRNA和PDE4D siRNA,48 h后收集各组细胞测定4种亚型mRNA及细胞内cAMP的表达水平;除空白对照组外,其余7组细胞在转染48 h后分别给予100μg·L-1LPS,刺激30 min后收集各组细胞测定细胞内cAMP的浓度。结果 PDE4 4种亚型蛋白均在小胶质细胞内表达;转染48 h后,PDE4A-siRNA、PDE4B-siRNA、PDE4C-siRNA和PDE4D-siRNA可分别明显抑制相应PDE4亚型mRNA的表达(P<0.05),各组细胞内cAMP的含量无明显改变(P>0.05);LPS刺激后各组细胞内cAMP的含量均比空白对照组明显增高(P<0.05),与LPS组相比,仅PDE4B-siRNA组细胞内的cAMP含量明显升高(P<0.05)。结论 PDE4B-siRNA可有效抑制PDE4B mRNA的表达并能明显升高LPS刺激后细胞内的cAMP含量。

鞘内注射PDE4A、PDE4C亚型特异性siRNA对L5脊神经结扎大鼠神经病理性疼痛的影响

目的观察鞘内分别注射针对磷酸二酯酶4A、4C亚型基因(phosphodiesterase 4A,PDE4A;phosphodiesterase 4C,PDE4C)的小干扰RNA(siRNA)对L5脊神经结扎(SNL)大鼠的痛觉高敏行为的影响。方法72只鞘内置管成功的成年雄性SD大鼠,随机均分为六组:假手术组(S组)、生理盐水组(NS组)、单纯载体组(Lipofectamin TM RNAiMAX,V组)、错配SiRNA组(M组)、PDE4A siRNA组(siR-A组)和DE4C siRNA组(siR-C组)。S组仅暴露L5脊神经,其余五组行SNL。S组、NS组分别在术后即刻、术后1、3、5、7d给予等量生理盐水10μl,其余四组分别给予Li-pofectamin TM RNAiMAX、错配SiRNA、PDE4A siRNA、PDE4C siRNA 2μg/10μl,并在术前1d、术后2、4、6、8d测定热缩足潜伏期(TWL)和机械缩足阈值(MWT),第8天行为学测定结束后处死大鼠,取腰段脊髓,采用western blot和ELISA法分别测定PDE4A、PDE4C的蛋白表达水平及肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β表达水平。结果与S组和siR-A组比较,其它四组大鼠PDE4A蛋白含量明显增加(P<0.05)。与S组和siR-C组比较,其它四组的PDE4C蛋白含量明显增加(P<0.05)。与S组比较,其它五组大鼠术后2、4、6、8dTWL明显减慢,MWT明显下降(P<0.05);术后第8天大鼠脊髓TNF-α和IL-1β含量明显升高(P<0.05)。结论鞘内分别注射PDE4A-siRNA、PDE4C-siRNA可明显抑制SNL大鼠腰脊髓段PDE4A、PDE4C蛋白的表达,但不能缓解大鼠机械和热痛觉高敏,抑制TNF-α、IL-1β的表达。

鞘内注射PDE4B-siRNA对L5脊神经结扎大鼠痛觉高敏的影响

目的观察鞘内注射针对磷酸二酯酶4B(PDE4B)基因的小干扰RNA(siRNA)对L5脊神经结扎(SNL)大鼠的热痛觉及机械痛觉高敏的影响。方法雄性SD大鼠70只,随机均分为假手术组(Sham组)、生理盐水组(NS组)、单纯载体组(V组)、错配siRNA组(siRNA-M组)和PDE4B-siRNA组(siRNA-B组),分别于神经结扎术后即刻以及术后1、3、5、7d鞘内注射生理盐水、生理盐水、LipofectamineRNAiMAX、错配siRNA 2μg和PDE4B-siRNA 2μg,容量均为10μl。PDE4B-siRNA、错配siRNA与载体均在注射前30min混匀。于术前1d及术后2、4、6、8d分别测定五组大鼠的机械缩足阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL);术后4、8d行为学测试结束后每组各处死6只大鼠,取腰段脊髓,采用实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和western bolt分别测定PDE4B的mRNA和蛋白表达。结果与术前1d比较,术后2、4、6、8dNS组、V组、siRNA-M组和siRNA-B组大鼠MWT明显缩短、TWL明显减小(P<0.05)。与NS组比较,术后2、4、6、8dsiRNA-B组大鼠MWT明显延长、TWL明显增加(P<0.05)。与Sham组比较,术后4、8dNS组、V组、siRNA-M组、siRNA-B组大鼠脊髓组织的PDE4B mRNA、PDE4B蛋白表达升高(P<0.05)。与NS组比较,术后4、8dB组大鼠脊髓PDE4B mRNA、PDE4B蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论鞘内注射PDE4B-siRNA可显著抑制L5SNL大鼠腰段脊髓PDE4B的mRNA和蛋白表达,有效缓解机械和热痛觉高敏。

磷酸二酯酶4B在脂多糖诱导大鼠小胶质细胞炎性因子释放中的作用

目的 评价磷酸二酯酶4B（PDE4B）在脂多糖诱导大鼠小胶质细胞炎性因子释放中的作用.方法 采用随机数字表法,将原代大鼠小胶质细胞分为5组（n=24）：对照组、脂多糖组、单纯载体组、错配小干扰RNA组（siRNA）组和PDE4B-siRNA组.对照组和脂多糖组不转染;单纯载体组给予脂质载体1 μl;错配siRNA组和PDE4B-siRNA组分别加入错配siRNA 2μl、PDE4B-siRNA 2 μl与脂质载体1μl（加入100μl无血清培养基中,siRNA终浓度为20 nmol/L）,各组转染或培养48 h后,采用Western blot法和RT-PCR法分别测定PDE4B蛋白与mRNA的表达,除对照组外其余各组加入含有脂多糖100 ng/ml的无血清培养基,培养24 h后采用ELISA法测定TNF-α及IL-1β释放水平,采用Western blot 法检测小胶质细胞细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）的蛋白表达.结果 与对照组相比,其余4组TNF-α和IL-1β释放水平升高,小胶质细胞p-ERK表达上调,PDFB-siRNA组小胶质细胞PDE4B蛋白及其mRNA表达下调（P＜0.05）,脂多糖组、单纯载体组和错配siRNA组差异无统计学意义（P＞0.05）;与脂多糖组相比,PDE4B-siRNA组TNF-α和IL-1β释放水平降低,p-ERK表达下调（P＜0.05）,单纯载体组和错配siRNA组差异无统计学意义（P＞0.05）.5组小胶质细胞ERK表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 PDE4B可促进脂多糖诱导的小胶质细胞炎性因子释放,机制与激活ERK有关.

磷酸二酯酶4B蛋白在神经病理性痛大鼠脊髓炎症反应中的作用：与ERK的关系

目的评价磷酸二酯酶（PDE）4B蛋白在神经病理性痛大鼠脊髓炎症反应中的作用及其与ERK的关系。方法健康雄性sD大鼠60只，体重180～220g，先行L5，6鞘内置管，第6天确定导管位置后，采用随机数字表法分为5组（n=12）：假手术组（Sham组）、生理盐水组（Ns组）、单纯载体组（V组）、错配siRNA组（siR—M组）及PDE4B—siRNA组（siR—B组）。结扎L5脊神经制备大鼠神经病理性痛模型。于结扎后即刻、第1、3、5、7天各组分别鞘内注射10μl生理盐水、10μl生理盐水、Lipofecta—min RNAiMAX、错配siRNA和Lipofectamin RNAiMAX包裹的PDE4B—siRNA（2pg／10μl）。术前1d及术后第2、4、6和8天分别测定大鼠机械痛阈；术后第8天行为学测试结束后处死大鼠取腰段脊髓，采用Westernbolt法检测PDE4B、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）的蛋白表达，ELISA法测定TNF—α、IL-1G和IL-6水平。结果与Sham组比较，Ns组、V组、siR—M组和siR—B组术后2、4、6和8d时机械痛阈降低（P〈0．05），v组和siR—M组术后2、4、6和8d时机械痛阈差异无统计学意义（P〉0．05），脊髓p-ERK、PDE4B蛋白、TNF—α、IL．1G和IL-6水平升高（P〈0．05）；与Ns组相比，siR—B组术后2、4、6和8d时机械痛阈升高，脊髓p-ERK、PDFAB蛋白、TNF-α、IL-18和IL-6水平降低（P〈0．05），V组和siR-M组上述指标比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论PDE4B蛋白参与了大鼠神经病理性痛的形成，可能与促进脊髓ERK磷酸化，增强炎性反应有关。