TAT介导的金属硫蛋白的穿膜效应及对细胞氧化损伤的修复作用

人类免疫缺陷病毒反式激活因子(human immunodeficiency virus transactivator,TAT)蛋白质转导肽是HIV-1编码的反式转录激活因子,富含碱性氨基酸序列,能够高效介导多种外源生物大分子通过多种膜性结构,例如细胞质膜和血脑屏障等。金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质,在维持生物体内金属含量动态平衡、重金属解毒以及防御氧化应激中均发挥重要作用。本研究通过基因重组技术制备由TAT介导的能跨膜进入细胞的重组融合蛋白质TAT-MT,使其进入细胞,高效发挥抗氧化损伤效应。通过体外抗氧化实验测定TAT-MT的体外羟自由基清除率及总抗氧化能力;免疫荧光技术检测其穿膜活性;MTT法研究其对H2O2诱导的293T细胞氧化损伤的修复作用。结果显示,通过长引物PCR技术在目的基因5′-端加入TAT序列,成功构建原核表达载体pET28a-TAT-MT;通过TAT标签的引入显著增加了MT的可溶性表达;进一步通过表达条件的优化成功获得了TAT-MT的高效可溶性表达;采用亲和层析方法对重组蛋白质进行了分离纯化;免疫荧光检测显示,重组蛋白质可以高效进入细胞;体外抗氧化结果显示,当TAT-MT浓度为100μmol/L时,羟自由基清除率达到94.87%±5.18%,说明TAT-MT具有较强的清除羟自由基的能力;MTT结果表明,重组蛋白质对H2O2诱导的293T细胞氧化损伤具有显著的(P<0.05)修复作用。本研究为MT的规模化制备及进一步开发其在生物医药、食品保健及化妆品领域的应用奠定了基础。