肺炎克雷伯菌ESBLs基因型分布与耐药相关性研究

目的研究聊城地区呼吸道感染患者中产ESBLs肺炎克雷伯菌相关耐药基因的分型及不同基因型与抗生素耐药性关系。方法收集2015年10-12月本院137例肺炎克雷伯菌阳性痰标本,比较分析基因型对抗生素的耐药性的关系。结果产ESBLs菌株对头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟和氨曲南的耐药率与非ESBLs菌株相比,差异有统计学意义（P〈0.05）;CTX-M型阳性菌株与阴性菌株相比,对抗生素头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南耐药率差异有统计学意义（P〈0.05）;SHV型阳性菌株与阴性菌株相比,对抗生素头孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦耐药率差异有统计学意义（P〈0.05）。结论通过检测肺炎克雷伯氏菌产ESBLs酶和ESBLs基因,分析ESBLs基因本院流行情况及常见基因与抗生素耐药关系,为指导临床医师合理用药提供可靠依据。

快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立

[目的]建立一种能快速区分、简便诊断西尼罗病毒感染的胶体金免疫层析试纸条方法。[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记西尼罗病毒NS1蛋白,采用双抗原夹心法制备胶体金免疫层析试纸条,对试纸条进行特异性和敏感性评价。[结果]该试纸条可在15min之内完成检测;在敏感性上,该试纸条对阳性血清的检测较美国Focus公司商品化的ELISA试剂盒检测低1个滴度;对89份阴性血清进行检测,试纸条检出9份阳性,ELISA试剂盒检出3份阳性,两种检测的符合率为86.52%,特异性为89.89%。[结论]初步建立了一种可以用于现场快速检测西尼罗病毒的胶体金免疫层析方法,为进一步大规模应用奠定了基础。

西尼罗病毒NS1蛋白的原核表达及其免疫原性研究

[目的]采用大肠杆菌表达系统表达西尼罗病毒NS1蛋白,并对表达产物进行免疫原性分析。[方法]将WNV NS1基因克隆入pET30a载体,获得重组表达质粒pET30a-WNV-NS1,并转化入BL21感受态细胞,将表达产物进行SDS-PAGE和W estern-blot分析,经N i+亲和层析纯化、阴离子交换层析后获得纯化的WNV NS1蛋白;将纯化产物免疫新西兰兔,获得的免疫血清作ELISA检测。将重组蛋白包板,检测FOCUS公司商品化试剂盒中的阳性血清。[结果](1)重组WNV NS1蛋白获得表达并纯化成功。(2)W estern blot结果显示表达的蛋白是带有H is标签的目的蛋白。(3)兔免疫血清的间接ELISA结果显示血清效价达到1:50000以上。(4)检测商品化试剂盒中的阳性血清,其OD450吸光值与阴性血清吸光值之比大于2。[结论]重组NS1蛋白能在大肠杆菌系统中获得表达;纯化产物具有免疫原性,而且可以作为抗原检测西尼罗病毒感染的血清,为进一步研究NS1蛋白的生物学特性及西尼罗病毒的诊断试剂奠定了基础。

哺乳动物细胞西尼罗病毒样颗粒表达、纯化及其鉴定

目的利用哺乳动物细胞表达含有西尼罗病毒(WNV)prM和E蛋白,形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),为西尼罗病毒感染的免疫诊断试剂的研制奠定基础。方法筛选典型西尼罗病毒株,构建重组质粒,转染293T细胞,表达并纯化西尼罗病毒prM-E蛋白,利用透射电镜、免疫印迹试验、间接免疫荧光实验(IFA)和酶链免疫吸附试验(ELISA)对表达产物进行鉴定。结果重组质粒转染细胞后产生病毒样颗粒(viruslike particles VLPs),转染细胞上清纯化物中透射电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的病毒样颗粒蛋白能够与抗西尼罗病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性;间接ELISA证实,重组蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在哺乳动物细胞中表达的西尼罗病毒样颗粒具有良好的抗原性,为西尼罗病毒感染快速特异诊断试剂研制奠定了基础。

新型洛菲不动杆菌的分离与鉴定

目的对从呼吸道感染的分泌物中分离的1株革兰阴性球杆样细菌进行研究,探讨其种系发生及分类学特征。方法利用形态、生理、生化特性等表型性状进行初步鉴定,通过细菌16S rRNA基因测序及基因比对明确其种系来源。结果分离菌为革兰阴性球杆状菌,生化反应不活泼,对环丙沙星耐药;BLAST序列比对显示该分离菌与洛菲不动杆菌的相似度为99.2%,与洛菲不动杆菌标准株不同的是在底物利用试验上有8项结果存在差异。结论根据表型性状和种系发生结果证实该菌为洛菲不动杆菌,鉴于该菌株与模式株在生化特性方面存在一定差异,初步考虑该菌株为洛菲不动杆菌的新亚型。

首次从前列腺液中分离到坎皮纳斯类芽胞杆菌

目的对分离自慢性前列腺炎患者前列腺液中的一株棒状样细菌进行多相分类学研究,确定其系统发生位置及分类学特征。方法利用形态、生理和生化特性等表型性状初步鉴定细菌,通过基因测序及比对明确其种系来源。结果分离、培养出革兰阳性棒状样杆菌,可形成芽胞;生化反应不活泼;BLAST序列比对显示,该分离株与坎皮纳斯类芽胞杆菌(Paenibacillus campinasensis)菌株324T的16SrDNA序列相似度为99.4%,仅存在9个核苷酸差异。结论从表型性状和种系发生结果可证实该菌为坎皮纳斯类芽胞杆菌。鉴于其与模式株在生化特征方面存在显著差异,初步考虑该菌株是坎皮纳斯类芽胞杆菌的新亚型。

圣路易斯脑炎病毒样颗粒的真核表达、纯化与鉴定

目的 利用293T细胞表达、纯化圣路易斯脑炎病毒样颗粒（Virus like particles,VLPs）,为研制圣路易斯脑炎病毒免疫诊断试剂奠定基础.方法 构建含圣路易斯脑炎病毒PrM和E基因的重组质粒pcDNA5/FRT-SJME,瞬时转染293T细胞,表达并纯化重组蛋白,通过透射电镜、间接免疫荧光试验、Western-Blot和ELISA对其进行鉴定.结果 表达的重组蛋白形成50 nm的球型颗粒,能与抗圣路易斯脑炎病毒抗体产生特异性反应,与部分黄病毒属阳性血清发生交叉反应.结论 已成功在哺乳动物细胞中表达并纯化了圣路易斯脑炎病毒样颗粒,其具有良好的抗原性和完整的颗粒形态,为进一步研制圣路易斯脑炎病毒感染的免疫诊断试剂奠定了基础.

甲型流感病毒亚型抗原肽合成及其免疫反应性比较鉴定

〔目的〕针对甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白同一区段不同亚型的合成肽,比较分析其免疫反应性和交叉反应性,获取具有免疫诊断学意义的抗原肽。〔方法〕通过生物信息学分析,针对新甲型H1N1、季节性H1N1、H2N2、H3N2和H5N1共5种亚型甲型流感病毒,选择2个HA肽段区位设计2组抗原肽段(19肽和23肽)合成,每组5条共10条,并分别与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)载体偶联形成全抗原后,免疫家兔制备兔源抗体,建立免疫反应性筛选的酶联免疫吸附法(ELISA),比较合成肽的免疫反应性。〔结果〕以阳性血清平均OD490nm/阴性血清平均OD490nm(P/N)值为判断标准,筛选出具有免疫反应性的2条特异性抗原肽(KYVKSTKLRLAT-GLRNVPS,VKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS),前者具有亚型特异反应性,后者则具有一定的亚型通用免疫反应性。〔结论〕筛选出具有免疫反应性合成肽抗原,为进一步建立流感病毒亚型的快速鉴定诊断方法奠定了基础。