小RNA深度测序技术分析西瓜花叶病毒蜀葵分离物

蜀葵病毒病害的发生对其生长造成严重影响,明确蜀葵病毒病害的种类及变异进化对蜀葵病毒病害的防治具有重要意义。利用小RNA深度测序技术对具有明显脉明、花叶症状的蜀葵叶片进行鉴定。结果发现,感病蜀葵被西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)、锦葵脉明病毒(Mala vein cleaning virus, MVCV)和一种新的RNA病毒[暂命名为蜀葵病毒1号(Althaea rosea virus1, ArV1)]所侵染。为进一步明确WMV蜀葵分离物(WMV-Tg)的进化关系,对病毒WMV-Tg全基因组进行扩增,获得全长为10 046个核苷酸序列(nt)。序列分析结果显示,WMV-Tg与已报道的WMV分离物基因组核苷酸序列的同源性为83.3%～90.2%。系统进化关系表明,WMV-Tg与WMV-Pg聚为一簇,亲缘关系最近。对蜀葵WMV-Tg来源的小RNA(WMV-derived small interfering RNAs, WMV-vsiRNAs)的长度分布、5′碱基偏好性、极性分布以及热点区分布的分析,有助于加深对WMV-vsiRNAs的了解,并为进一步研究病毒来源的小RNA(virus-derived small interfering RNAs, vsiRNAs)在抗病毒防御中的功能,以及为蜀葵病毒病的防治奠定理论基础。

黄芩中FNSII-1与CHS-2真核表达载体的构建

[目的]FNSII-1与CHS-2分别是黄芩叶与根中合成黄芩活性物质通路中的关键酶基因,本试验拟通过构建FNSII-1和CHS-2与载体pYES-dest52的重组质粒,进行酵母真核表达,为探索黄芩活性物质体外大规模合成途径奠定基础。[方法]通过设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,利用Gateway重组技术将目的基因FNSII-1和CHS-2整合至目的载体pYES-dest52上得到重组质粒,随后将其转到酿酒酵母INVSc1菌株中,通过SDS-PAGE检测分析并确定酵母蛋白表达最佳条件。[结果]经RT-PCR扩增得到的目的基因FNSII-1与CHS-2,其片段长度分别为1491 bp、1205 bp,与理论值相符。重组质粒经测序与比对,2个基因与其相应NCBI数据库的信息相似性分别为94.18%和91.77%。酵母菌株在5种不同OD 600值下蛋白均能稳定表达。[结论]本研究成功构建了pYES-dest52-FNSII-1和pYES-dest 52-CHS-2重组载体和FNSII-1和CHS-2蛋白表达体系,为黄芩中活性物质的体外合成奠定基础。

菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析

杭白菊作为著名的中药"浙八味"之一,种植规模和产区不断扩大,但其病毒病的发生也日益严重,对其产量和品质造成严重影响。本研究利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)等方法,对感病杭白菊病原物进行鉴定,为杭白菊病毒病原的检测构建一套快速和简便的方法。结果表明,感病杭白菊被菊花R病毒(Chrysanthemum virus R,CVR)侵染,将其命名为CVR-TX。通过对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其全长基因组为8872 bp,编码6个ORF,具有Carlavirus属病毒的典型特征。基于全基因组核酸序列以及复制酶、外壳蛋白氨基酸的序列比对发现,CVR-TX与CVR-BJ同源性最高,分别为85.5%、96.0%和96.3%;与Carlavirus属其他病毒同源性分别在48.2%~54.4%、46.9%~55.3%和36.8%~59.5%,因此CVR被确定为一种新的Carlavirus属病毒。系统进化分析表明,基于全长基因组、复制酶(replicase)基因和外壳蛋白(coat protein,CP)基因与CVR-BJ聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了CVR-TX的全长基因组,丰富了CVR的基因组信息,通过生物信息学分析明确其种属关系和区域变化情况,从而为建立CVR可靠灵敏的分子检测手段和有效的防控措施提供理论基础。

大豆花叶病毒半夏分离物侵染性克隆构建及鉴定

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)作为半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)主要病毒病害之一,已对其产量和品质造成严重影响。构建病毒侵染性克隆是反向遗传学研究病毒基因功能、病毒与宿主相互作用的有力工具,为明确SMV侵染半夏的分子机制,开展SMV全长cDNA侵染性克隆的构建特别重要。因此文中利用Gibson体外重组系统对大豆花叶病毒山西半夏分离物(SMV-SXBX)侵染性克隆进行组装,通过农杆菌浸润法接种健康半夏;进一步通过机械传代、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)证实SMV-SXBX侵染性克隆3′末端含有poly(A)尾56 nt时具有稳定侵染性。该方法便捷、高效,且避免了SMV侵染性克隆在大肠杆菌中的不稳定问题。SMV全长侵染性cDNA克隆的构建,为进一步研究SMV复制和发病的分子机制奠定了基础。