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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
1
作者
王永飞
邓博文
+5 位作者
刘晓艳
哈尔勒哈·阿曼太
郭嘉栋
周正国
蔡江
李有文
《中国畜牧兽医》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第2期689-699,共11页
[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu...
[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。
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关键词
绵羊肺炎支原体
重叠延伸PCR
EF-Tu基因
多克隆抗体
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职称材料
绵羊肺炎支原体核糖体蛋白30S rpsE基因的原核表达及多克隆抗体的制备
2
作者
刘晓艳
王永飞
+3 位作者
邓博文
哈尔勒哈·阿曼太
蔡江
李有文
《畜牧与兽医》
CAS
2024年第7期78-84,共7页
旨在了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)30S rpsE蛋白的生物学特性及其蛋白免疫原性。用在线分析软件预测30S rpsE蛋白的理化性质、B细胞抗原表位、糖基化位点、二级结构及三级结构等;采用PCR方法从病羊鼻拭子样品中扩增得到...
旨在了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)30S rpsE蛋白的生物学特性及其蛋白免疫原性。用在线分析软件预测30S rpsE蛋白的理化性质、B细胞抗原表位、糖基化位点、二级结构及三级结构等;采用PCR方法从病羊鼻拭子样品中扩增得到30S rpsE基因片段,经NdeⅠ、XhoⅠ酶切纯化后,将其连接到pET-42b载体上,构建原核表达载体pET-42b-30S rpsE,使用不同浓度IPTG诱导蛋白在大肠杆菌BL21中表达;重组蛋白通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用镍层析法纯化蛋白后,与弗氏佐剂1∶1混合注射免疫家兔,然后采取全血,检测血清抗体效价及特异性。结果:经预测30S rpsE蛋白是亲水无信号肽的膜外蛋白,无跨膜结构域,有一个糖基化位点;成功构建了原核表达载体pET-42b-30S rpsE,表达的重组蛋白分子量约为25.9 ku,以包涵体和可溶性的形式存在;免疫家兔后血清抗体效价为1∶25 600,证实30S rpsE蛋白具有较好的免疫原性。
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关键词
肺炎支原体
30S
rpsE基因
原核表达
多克隆抗体
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职称材料
题名
绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
1
作者
王永飞
邓博文
刘晓艳
哈尔勒哈·阿曼太
郭嘉栋
周正国
蔡江
李有文
机构
塔里木大学动物科学与技术学院
新疆生产建设兵团南疆动物疫病诊断与防控工程实验室
阿克苏职业技术学院
出处
《中国畜牧兽医》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第2期689-699,共11页
基金
新疆生产建设兵团区域创新基金项目(2021BB014)
塔里木大学校长基金项目(TDZKCX202305)。
文摘
[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。
关键词
绵羊肺炎支原体
重叠延伸PCR
EF-Tu基因
多克隆抗体
Keywords
Mycoplasma ovipneumoniae
overlapping extension PCR
EF-Tu gene
polyclonal antibody
分类号
S852.62 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
绵羊肺炎支原体核糖体蛋白30S rpsE基因的原核表达及多克隆抗体的制备
2
作者
刘晓艳
王永飞
邓博文
哈尔勒哈·阿曼太
蔡江
李有文
机构
塔里木大学动物科学与技术学院
出处
《畜牧与兽医》
CAS
2024年第7期78-84,共7页
基金
新疆生产建设兵团区域创新基金项目(2021BB014)
塔里木大学校长基金项目(TDZKCX202305)。
文摘
旨在了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)30S rpsE蛋白的生物学特性及其蛋白免疫原性。用在线分析软件预测30S rpsE蛋白的理化性质、B细胞抗原表位、糖基化位点、二级结构及三级结构等;采用PCR方法从病羊鼻拭子样品中扩增得到30S rpsE基因片段,经NdeⅠ、XhoⅠ酶切纯化后,将其连接到pET-42b载体上,构建原核表达载体pET-42b-30S rpsE,使用不同浓度IPTG诱导蛋白在大肠杆菌BL21中表达;重组蛋白通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用镍层析法纯化蛋白后,与弗氏佐剂1∶1混合注射免疫家兔,然后采取全血,检测血清抗体效价及特异性。结果:经预测30S rpsE蛋白是亲水无信号肽的膜外蛋白,无跨膜结构域,有一个糖基化位点;成功构建了原核表达载体pET-42b-30S rpsE,表达的重组蛋白分子量约为25.9 ku,以包涵体和可溶性的形式存在;免疫家兔后血清抗体效价为1∶25 600,证实30S rpsE蛋白具有较好的免疫原性。
关键词
肺炎支原体
30S
rpsE基因
原核表达
多克隆抗体
Keywords
Mycoplasma ovipneumoniae
30S rpsE gene
prokaryotic expression
polyclonal antibody
分类号
S852.62 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
王永飞
邓博文
刘晓艳
哈尔勒哈·阿曼太
郭嘉栋
周正国
蔡江
李有文
《中国畜牧兽医》
CAS
CSCD
北大核心
2024
0
下载PDF
职称材料
2
绵羊肺炎支原体核糖体蛋白30S rpsE基因的原核表达及多克隆抗体的制备
刘晓艳
王永飞
邓博文
哈尔勒哈·阿曼太
蔡江
李有文
《畜牧与兽医》
CAS
2024
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职称材料
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