不同灵芝菌丝体水提物对乙醇诱导LO2肝细胞损伤的保护作用

为了探讨不同灵芝菌丝体水提物对乙醇诱导LO2肝细胞损伤的保护作用,本文分析了7种不同灵芝菌株发酵菌丝体水提物对乙醇诱导LO2细胞损伤的保护作用。利用乙醇诱导LO2细胞建立体外肝损伤模型,并以细胞存活率、谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和丙二醛(Malondiadehyde,MDA)水平为指标考察灵芝菌丝体水提物对乙醇诱导LO2细胞损伤的保护效果。结果表明,7种灵芝菌株的菌丝体水提物均具有不同程度的保护作用。综合比较,G0119与G0154菌丝体的水提物作用效果较优,相较模型组,LO2细胞存活率显著提高(P<0.05),细胞培养液中的ALT、AST活力显著降低(P<0.05),细胞内ROS水平显著降低(P<0.05),SOD活力、GSH含量显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。经相关性分析,发现水提物中多糖组分2的分子量大小与其保肝活性呈正相关,即分子量越大,活性越强。综上,灵芝菌丝体水提物对乙醇诱导的体外肝损伤起到保护作用,并且G0119与G0154菌株的作用效果较优,其保肝作用与提取物中多糖组分的分子量大小相关。

高产三萜灵芝新菌株‘沪农灵芝5号’的选育

为选育高产三萜灵芝(Ganoderma lucidum)新品种,以抗杂菌能力强、生物学效率高的‘沪农灵芝1号’(H 1)和三萜含量高、抗杂菌能力弱的‘灵芝G 8’(G 8)为亲本,将原生质体单核菌株进行杂交,从130个杂交组合中筛选出菌丝长势较好的25个杂交菌株,并对其进行栽培试验,考察菌包成品率、生物学效率等农艺性状及子实体三萜含量,从中筛选出杂交菌株Z18。与亲本G8相比,Z18菌包成品率提高66.67%、生物学效率提高22.54%;与亲本H1相比,Z18子实体中三萜含量提高51.26%。ERIC-PCR分析结果显示,Z18与亲本存在遗传差异。Z18达到新品种审定标准,已通过上海市非主要农作物品种认定,定名为‘沪农灵芝5号’。

高多糖含量灵芝新品种‘沪农灵芝4号’选育

为选育高多糖含量灵芝(Ganoderma lucidum)新品种,以‘龙芝2号’(简称‘201’)为出发菌株,对其原生质体进行紫外诱变,获得806个再生菌株,从中筛选出153个与出发菌株具有拮抗反应,菌丝长势较好且稳定的突变株,并利用随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)和简单重复序列(inter-simple sequence repeat,ISSR)分子标记进行聚类分析,结合菌株菌丝体的生物学特性,从聚类分组中选取具代表性的56个突变株进行出芝试验。基于子实体多糖含量、菌棒成品率、菌棒出芝率和子实体产量,从中筛选到综合指标最优的突变株L2-UV59。L2-UV59子实体产量0.103 kg·kg^(-1)干料,多糖含量2.24%,分别较出发菌株提高37.33%和34.13%。示范栽培结果表明,L2-UV59在大田栽培中性状稳定,具有良好的商业应用价值。L2-UV59已通过上海市非主要农作物品种认定,定名为‘沪农灵芝4号’。

食药用菌液体发酵产品在食品领域应用进展

食药用菌中富含多种营养和活性成分,应用液体发酵技术可获得品质稳定、产量可控的功能性原料。文章总结了食药用菌液体发酵产品在食品领域中的应用现状,以及食药用菌液体发酵产品在食品领域的相关规定,并对食药用菌液体发酵原料在食品领域推广应用、相关规定的完善和未来加工产品开发的应用前景进行了展望。

灵芝三萜类物质液态发酵研究进展

灵芝三萜类活性成分主要来源于灵芝子实体、孢子及菌丝体。液态发酵合成灵芝三萜因生产周期短、发酵条件易控制、活性成分稳定等优点逐渐受到关注。近年来,除了在培养基和环境条件等方面对灵芝三萜液态发酵调控参数进行优化外,添加外源物提升灵芝三萜产量也是一种很好的调控手段。本文就灵芝三萜生物合成途径、液态发酵高产灵芝三萜的培养条件调控、外源物对液态发酵高产灵芝三萜的影响以及代谢通量在灵芝三萜液态发酵合成方面的应用前景进行介绍。

一株野生树舌灵芝菌株鉴定及其液态发酵特性

为进一步丰富灵芝真菌资源,对从野外桃树上采集的灵芝子实体,采用形态学观察和ITS序列比对进行菌种鉴定,并对其摇瓶发酵液的菌丝体生物量和胞内外代谢物特性进行分析。结果表明:该灵芝菌株在分类上属于多孔菌科灵芝属,学名为树舌灵芝,序列上传GenBank,登录号为OK037622。液态发酵研究表明,其菌丝体生物量为15.16 g∕L,底物葡萄糖利用率为77.63%,胞内外多糖含量和质量浓度分别为16.04 mg∕g和1.23 g∕L,胞内代谢物主要有糖醇类(45.07%)、糖类(40.05%)、脂肪酸类(13.33%),胞外代谢物主要有氨基酸类(40.02%)、糖类(15.74%)、糖酸类(12.09%)、糖醇类(9.85%)、脂肪酸类(6.28%)、有机酸类(5.82%)、酯类(4.34%)、醇类(2.83%)、核苷类(2.79%)。该研究可为下一步开展灵芝研究提供菌种准备,并为后续的开发应用提供参考。

基于CRISPR/Cas9方法构建‘沪农灵芝1号’基因编辑系统

构建密码子优化的cas 9表达质粒pMD-EXP-cas 9,通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化灵芝(Ganoderma lucidum)菌株‘沪农灵芝1号’(‘Hunong No.1’)单核菌株L1,得到含有cas9完整表达盒的菌株L1-cas9。利用T7启动子构建靶向ura3基因的表达质粒psgRNA-1和psgRNA-2,体外转录后得到sgRNA 1和sgRNA 2。通过PEG介导的转化,将sgRNA 1和sgRNA 2转化进L1-cas9的原生质体中,得到ura3基因被破坏的突变体,首次在‘沪农灵芝1号’菌株单核体中构建成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑系统,ura3基因的编辑效率为4个突变体(107个原生质体)。利用0.006%曲拉通X-100优化PEG介导的转化系统,可使ura3基因编辑效率提高至18个以上突变体(107个原生质体),本研究的结果为灵芝基因功能的研究和分子育种提供更高效的方法。

沪农系列灵芝新品种活性成分及免疫活性对比研究

以相同条件下栽培获得的沪农系列7个不同品种的灵芝(Ganoderma lucidum)子实体作为研究材料,分析比较其总多糖、核苷、三萜和糖醇的含量、多糖重均分子量分布特征差异以及刺激RAW 264.7巨噬细胞释放NO的活性。结果表明:不同品种灵芝总多糖含量在1.15%~5.11%之间,含量较高的3个品种由高到低为‘沪农芝7号’(5.11%)、‘沪农芝8号’(2.36%)、‘沪农灵芝4号’(2.07%)。不同灵芝品种粗多糖分子量分布存在差异,‘沪农灵芝4号’主要含有重均分子量为3.38×10^(6)、4.24×10^(6)、4.38×10^(3)g·mol^(-1)的三个多糖组分,‘沪农灵芝1号’主要含有重均分子量为1.01×10^(7)和8.03×10^(3)g·mol^(-1)的两类多糖组分,‘沪农芝7号’主要含有重均分子量为4.50×10^(5)、6.20×10^(3)g·mol^(-1)的两个多糖组分,其余4个品种均含有重均分子量为(4.56×10^(3)~5.47×10^(3))g·mol^(-1)的多糖组分。7个灵芝新品种子实体中均含有胞苷、尿苷、鸟苷,其中‘沪农灵芝4号’的总核苷含量最高(1456.5μg·g^(-1));总三萜的含量为2241.93~5123.54μg·g^(-1),最高的为‘沪农灵芝1号’(5123.54μg·g^(-1));不同灵芝品种的糖醇含量存在一定差异,主要含有阿拉伯糖醇和甘露糖醇,赤藓糖醇含量较低,均低于0.9 mg·g^(-1)。七种灵芝子实体的粗多糖浓度在50~500μg·mL^(-1)范围内均能增强RAW 264.7巨噬细胞NO的释放量,其中‘沪农灵芝5号’的活性最强。研究结果将为沪农系列灵芝新品种的开发利用和推广应用提供参考。

近五年灵芝物理诱变育种研究进展

灵芝(Ganoderma spp.)是一类药食两用的大型真菌,灵芝具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎症、降血糖、降血脂等功能。不同的灵芝品种对以其为原料开发的保健食品和药品的有效性和质量稳定性具有重要影响,因此,优良新品种的选育对灵芝产业的发展具有重要意义。物理诱变是当今工业微生物育种中重要且有效的技术之一,笔者总结近五年物理诱变技术在灵芝育种中的应用,分析灵芝物理诱变育种中存在的问题,展望采用物理诱变育种创制灵芝新品种的前景,以期为今后的灵芝育种研究提供有益参考。

灵芝三萜结构和生物活性及高产三萜菌株的研究进展

灵芝(Ganoderma spp.)是著名的药用真菌,含有多种活性化合物,灵芝三萜是其主要的活性代谢成分之一,具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖等功能。笔者总结了灵芝三萜的分离纯化、结构、生物活性及高产三萜育种工作的研究进展,并对今后灵芝的研究工作进行展望,以期为灵芝三萜的开发利用提供参考。

灵芝亲本及其杂交菌株液态发酵胞外多糖理化特征及刺激Dectin-1受体和巨噬细胞活性比较

在相同条件下分别液态发酵培养赤芝(Ganoderma lucidum)G0119、G0154及其杂交菌株GZ36,比较不同发酵时间(24、48、72、96 h)所得胞外多糖的含量、重均分子量分布特征、单糖组成特征和免疫活性差异。结果表明:3个菌株的胞外液在21~26、34~44 min时间段均出现2个峰(P1、P3),而GZ36在26~33 min时出现峰P 2。在实验范围内,随着发酵时间延长,3个菌株的不同组分含量均呈现增加趋势。发酵终点72 h的胞外多糖P1、P2、P3的重均分子量分别为5.193×10^(6)~8.957×10^(6)、4.437×10^(6)、6.033×10^(4)~8.148×10^(4)g·mol^(-1)。与60%乙醇沉淀组分(60 E)相比,3个菌株胞外多糖的20%乙醇沉淀(20 E)组分的产量较高。与亲本菌株G0119、G0154的20E组分相比,杂交菌株GZ36的20E组分产量(0.46 g·L^(-1))较高,其多糖含量(82.96%)也较高;3个菌株的60E组分相比,菌株GZ36、G0154的产量(0.13、0.14 g·L^(-1))较高,菌株GZ36的多糖含量(78.76%)较高。杂交菌株GZ 36胞外多糖20 E组分(主要由葡萄糖组成)和60 E组分(主要由木糖组成)在单糖组成和比例上更接近亲本菌株G0154。与阴性对照相比,3个菌株的胞外多糖20E组分均表现出刺激Dectin-1受体的活性;60E组分均具有诱导巨噬细胞释放NO的活性。与亲本菌株相比,在200μg·mL^(-1)时,杂交菌株GZ36的60 E组分活性较强。研究结果为了解灵芝亲本与杂交菌株胞外多糖的异同提供参考。

基于人工神经网络和遗传算法优化灵芝液态发酵培养基

以灵芝(Ganoderma lucidum)胞内相对分子质量较高的多糖组分的峰面积为指标,采用单因素实验筛选液态发酵培养基的氮源及其浓度,按照Box-Behnken设计29个实验组,并进行发酵培养实验,建立数据集;将数据集随机分为训练集(24组)和测试集(5组),训练集用于构建BP神经网络模型,测试集用于评估模型,采用遗传算法对BP神经网络的拟合结果进行寻优。结果表明:模型拟合度可达0.9848;最佳培养基组成为29.0 g·L^(-1)无水葡萄糖、3.7 g·L^(-1)酵母自溶粉、0.3 g·L^(-1)MgSO_(4)·7H_(2)O,采用优化后的发酵培养基培养比未优化的基础培养基培养获得的相对分子质量较高的多糖峰面积提高40.8%。

基于rDNA ITS序列和ERIC-PCR研究虫草真菌无性分离物的遗传多样性

以24株虫草无性分离物和1个蛹虫草子实体为材料,利用ITS序列分析和ERIC-PCR方法对这些材料进行了遗传多样性分析。结果表明:ITS序列分析表明蝉花的无性分离物4645(菌生轮枝菌Lecanicillium fungicola)与蝉花的无性分离物4644和4646及蛹虫草的无性分离物亲缘关系较近,而冬虫夏草无性分离物4634及4636则为膨大弯颈霉Tolypocladium inflatum;蛹虫草Cordyceps militaris无性型与蝉花Cordyceps cicadae无性型(4644、4646)及无性分离物4645聚成一族,而冬虫夏草分离物4634及4636与冬虫夏草的关系较近,聚成另一族。ERIC-PCR分析结果表明,在相似性系数为0.76时,上述分离物分成4组,即1)L.fungicola;2)T.inflatum;3)C.cicadae;4)C.militaris。上述结果表明虫草无性分离物具有丰富的遗传多样性。同时,本研究检测了上述无性分离物胞外液中虫草素的含量,发现所有蛹虫草无性分离物(除1811之外)的胞外液中均含有虫草素,但蝉花和冬虫夏草的无性分离物(4634、4636、4644、4645和4646)胞外液中的虫草素产量极低,甚至无法检测出。

灵芝属菌株遗传多样性的初步研究

利用RAPD和酯酶同工酶技术对来自国内外的10个灵芝属代表菌株进行了遗传多样性分析。RAPD分析结果表明,在0.560的相似性水平上分成3个组:第1组包括密纹薄芝(1号)、两个灵芝(3号和4号)和两个无柄灵芝菌株(7号和8号);第2组包括灵芝(2号)、近拟鹿角灵芝(5号和6号)和紫芝(10号);第3组是树舌(9号)。这一结论与传统分类学结论基本一致。当相似性水平达到0.800时,上述10个菌株聚成8组,这与传统分类学中种的分类几乎一致。酯酶同工酶的分析结果表明,在0.560的相似性水平上,所有菌株分为两组:第一组是树舌(9号);其他菌株构成一组。这一结论与传统分类学结论也一致。当相似性水平达到0.800时,上述菌株分为7组:其中3号、4号、7号和8号构成一组,其余的同RAPD结果。比较两种方法所得结果发现,在较高的相似性水平(0.840)上,它们的结论是一致的。这表明,RAPD和酯酶同工酶技术在灵芝种间鉴定时是有效的,甚至RAPD在种内鉴定时都是有效的。

灵芝属分类学研究进展

概述了形态学特征、同工酶技术以及分子生物学技术在灵芝分类上的应用现状,指出了灵芝分类中存在的问题,并提出了相应的对策。

基于rDNAITS和beta-tubulin gene部分序列分析灵芝属菌株的遗传关系

联合ITS序列和beta-tubulin基因部分序列的系统发育分析将分属于8个种的38株菌株分为9个聚类群,聚类结果与物种结果基本一致,只有少数几个菌株,如GL81菌株聚类结果与拉丁名不符,可能由于来源地给出的定名不够准确。根据结果联合信息分析可以对收集的不同菌株进行种类的初步分析。

‘沪农灵芝1号'品种斜面母种的不同接种部位对灵芝子实体产量及品质影响的初步研究

通过比较‘沪农灵芝1号'斜面母种的最薄处、中间部位及最厚处的菌落栽培生产的子实体,发现斜面母种中间部位栽培产生的子实体厚度、产量及多糖含量最高,但三萜的含量最低;斜面最厚处产生的子实体厚度、产量及多糖含量次之,三萜的含量较高;斜面最薄处产生的子实体的厚度、产量及多糖含量均最低,但三萜的含量最高。

基于体细胞不亲和性及ERIC-PCR研究虫草无性分离物的亲缘关系

通过对22个从虫草菌体分离到的无性菌株进行体细胞不亲和性试验,发现几乎所有菌株之间都存在程度不同的不亲和性。利用ERIC-PCR方法进行分析,发现这些供试菌株在相似性系数为0.62的水平上分成两个类群,即①蛹虫草的无性分离物(Cordyceps militaris)及冬虫夏草的分离物(Elaphocordyceps subsessilis)、②蝉花的无性分离物(Lecanicillium fungicola);在相似性为0.64的水平上被分成3组,即①C.militaris、②E.subsessilis、③L.fungicola;当相似性水平高于0.92时,19个C.militaris菌株被各自分开。ERIC-PCR分析结果与体细胞不亲和性试验的结果具有较高的一致性。利用上述两种方法分析的结果都显示这些无性分离物具有丰富的遗传多样性。

基于rDNA ITS序列探讨中国栽培灵芝菌株的亲缘关系

利用ITS序列分析技术对中国栽培灵芝菌株进行了亲缘关系分析。结果发现中国栽培灵芝菌株分布于5个聚类组,其中树舌亚属、紫芝组的菌株各自聚成一组,灵芝组的菌株分成3组,85·7%灵芝组菌株均聚于同一组,表明树舌亚属、紫芝组和灵芝组间的遗传差异较大,灵芝组内虽然存在着一定的遗传差异,但总体上亲缘关系比较近,遗传多样性并不丰富。聚类结果也表明仅仅根据形态学特征并不能将灵芝属菌株进行有效的分类,利用分子生物学的技术手段对灵芝菌种进行分类是一种更有效的方法。

蛹虫草及其培养基中主要核苷类成分的分析比较

采用高效液相色谱法测定虫草中的核苷类成分,优化后的色谱条件为YMC-Polyamine柱(250mm×4.6mm,5μm);采用梯度洗脱,流动相:乙腈-水(V/V):0～15min为90:10,15～20min为86.5:13.5,20～30min为75:25,30～35min为70:30;流速:1mL/min;柱温:30℃;检测波长:259nm;进样量:10μL。结果表明:胸腺嘧啶、虫草素、尿嘧啶、腺苷、腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤均能得到较好分离,该方法稳定性好、精密度高、重现性好,适用于虫草中的核苷类成分的分析。经分析发现,蛹虫草子实体核苷类物质组成大致相似,但含量差异非常显著,同时发现蛹虫草培养基残基及固体发酵产物中虫草素含量较高,其他核苷类成分很少,因此认定蛹虫草培养基残基及固体发酵产物是非常优良的分离纯化虫草素的原料。