程序性坏死在氟致人成骨细胞氧化性损伤中的作用

目的探究程序性坏死与氟诱导的人成骨细胞氧化损伤的关系。方法选择人成骨肉瘤细胞系(Saos-2)体外培养,并用不同浓度的氟化钠(0、5、10、20、40 mg/L)干预以建立氟致成骨细胞损伤模型;利用分光光度法测定细胞中T-SOD、GSH、MDA的含量。结果实验组中T-SOD的活力及GSH的含量均低于相同染氟条件下的对照组(P<0.05);T-SOD的活力及GSH的含量随处理浓度的增加而下降,两者存在明显负相关(-1<r<0,P<0.05);干预时间对于细胞中T-SOD的活性和GSH的含量的影响存在双向性,即在氟干预浓度小于20 mg/L时,T-SOD的活力和GSH的含量与干预时间呈正相关,在氟干预浓度大于20 mg/L时,T-SOD的活力及GSH的含量与干预时间呈负相关;实验组中MDA的含量均高于相同染氟条件下的对照组(P<0.05);MDA的含量随着氟诱导浓度的增加而增加,两者存在明显正相关(0<r<1,P<0.05);在实验组中,干预时间对于细胞中MDA的含量的影响存在单向性,细胞中MDA的含量与干预时间呈正相关,而在对照组中,出现了与T-SOD和GSH相反的趋势。结论氟诱导过程中成骨细胞程序性坏死发生与氧化损伤有关。

氟对成骨细胞骨钙素和Ⅰ型胶原基因表达的影响

目的探讨氟对成骨细胞骨钙素基因(OCN)和Ⅰ型胶原蛋白基因(COL1)表达的影响。方法采用人成骨肉瘤细胞系(Saos-2)建立体外染氟模型,即经体外细胞培养后分别以不同浓度梯度氟化钠(0.0 mg/L,5.0 mg/L,10.0 mg/L,20.0 mg/L和40.0 mg/L NaF)处理;在实验组中加入坏死凋亡抑制剂(Necrostatin-1,Nec-1)抑制细胞的程序性坏死,提取细胞的总mRNA,通过实时荧光定量RT-PCR方法,分析染氟对Saos-2细胞骨钙素基因和Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响。结果与对照组相比,经5.0 mg/L,10.0 mg/L,20.0 mg/L和40.0 mg/L NaF处理后,OCN和COL1的表达域上调,其中以(5.0~10.0 mg/L)增强的最明显。低浓度氟化钠(5.0~10.0 mg/L)可以促进OCN和COL1的基因表达,高浓度(>20.0 mg/L)氟化钠对OCN和COL1基因的相对表达量上调程度较低;加入Nec-1的组OCN和COL1基因表达域较对照组上调明显。结论在基因水平上,低浓度氟化钠(5.0~10.0 mg/L)上调人成骨细胞中OCN和COL1基因的表达;高浓度氟化钠(>20.0 mg/L)对OCN、COL1基因的相对表达量的上调程度较低。Nec-1对两基因的表达均为上调。氟诱导的程序性坏死能够影响成骨相关基因OCN和COL1的表达。

氟诱导成骨细胞程序性坏死的实验研究

目的探讨程序性坏死通路受体相互作用蛋白1-受体相互作用蛋白3-混合系列蛋白激酶样结构域(RIP1-RIP3-MLKL)是否参与氟诱导的成骨细胞死亡。方法体外培养人成骨肉瘤细胞株(Saos-2细胞),按如下分组分别处理24、48 h:对照组,氟化钠(NaF)组(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NaF),程序性坏死抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)组(50.0μmol/L Nec-1),NaF+Nec-1组(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NaF+50.0μmol/L Nec-1),采用CCK-8法检测细胞增殖情况,化学比色法检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性。为进一步分析NaF对RIP1-RIP3-MLKL通路的影响,将Saos-2细胞分为对照Ⅱ组和NaFⅡ组(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NaF),分别处理24、48 h,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平。结果各组处理24、48 h时细胞增殖率(%:100.00±0.59、104.90±0.44、104.16±0.41、82.45±1.91、64.59±1.83、103.56±0.41、107.18±0.87、105.35±1.28、89.63±1.20、77.51±1.30,100.00±0.33、107.92±0.44、101.78±1.06、75.45±0.39、57.94±1.17、106.74±0.21、111.85±0.21、107.82±0.68、82.34±0.56、70.19±0.99)比较,差异均有统计学意义(F=77.13、2313.43,P均<0.05)。除10.0 mg/L NaF+Nec-1组处理24 h时细胞增殖率与10.0 mg/L NaF组比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各浓度NaF+Nec-1组处理24、48 h时细胞增殖率较对应浓度NaF组均显著升高(P均<0.05)。Saos-2细胞增殖率与染氟浓度呈负相关(r24 h=-0.976,r48 h=-0.969,P均<0.001)。与对照组比较,各浓度NaF组处理24、48 h时LDH活性均较高(P均<0.05);且各浓度NaF+Nec-1组处理24、48 h时LDH活性较对应浓度NaF组均显著降低(P均<0.05)。Saos-2细胞LDH活性与染氟浓度呈正相关(r24 h=0.985,r48 h=0.988,P均<0.001)。与对照Ⅱ组比较,5.0 mg/L NaFⅡ组处理24 h时RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平及处理48 h时RIP3蛋白表达水平均较高;10.0、20.0、40.0 mg/L NaFⅡ组处理24、48 h时RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平均较高(P均<0.05)。Saos-2细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平与染氟浓度呈正相关(r24 h-RIP1=0.881,r48 h-RIP1=0.952,r24 h-RIP3=0.867,r48 h-RIP3=0.938,r24 h-MLKL=0.758,r48 h-MLKL=0.907,P均<0.001)。结论氟通过RIP1-RIP3-MLKL通路直接引起成骨细胞程序性坏死,细胞受损的严重程度与染氟浓度密切相关,Nec-1可以部分逆转氟的影响。