表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组耐热新城疫病毒株的鸡胚传代研究

新城疫和禽流感严重危害世界养禽业,对其防控在我国主要依赖疫苗接种。课题组前期获得了一株可表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组耐热新城疫病毒rTS-HA株。进一步对其鸡胚传代特性进行研究,旨在分析重组新城疫病毒在传代过程中的热稳定性和外源基因表达稳定性。将其在SPF鸡胚传至18代,每隔4代耐热选育1次,取中间代次毒株,测定其增殖效价、鸡胚最小致死剂量的平均死亡时间(mean death time,MDT),同时设置未耐热选育的对照。结果表明,通过耐热选育将rTS-HA株传至第18代后,其增殖滴度未发现显著变化,MDT均大于120 h,表明毒力无返强现象,但其耐热性有显著提升,而未进行耐热选育的鸡胚传代株的耐热特性显著下降。动物试验结果表明,耐热选育后毒株的免疫效果较初代毒株也有明显的提升。以上结果表明重组新城疫病毒rTS-HA株需要进行耐热选育传代,才能保持其耐热特性,同时其免疫原性也有一定的提升,可作为新城疫和禽流感二联耐热基因工程活疫苗的候选毒株。

新城疫病毒HN蛋白膜外区的纯化

血凝素神经氨酸酶(HN)是新城疫病毒(NDV)囊膜表面的糖蛋白之一,其在病毒表面的含量非常丰富,影响NDV的很多生物学特性,如热稳定性等。利用TritonX-100破坏病毒囊膜结构,分离囊膜糖蛋白,最后通过蛋白酶酶切和高速离心的方法获得了较为纯净的HN蛋白胞外区的蛋白样品,建立了从NDV粒子上纯化HN蛋白胞外区的方法。利用该方法获得的HN蛋白样品可以保持天然蛋白的结构、化学修饰和功能,能够更好地用于研究HN蛋白结构功能和生物学特性的形成机制,为新城疫病毒的基础研究、新城疫病毒载体改良应用和新城疫疫苗的研发奠定了基础。

基于马赛克HA序列的H9亚型禽流感灭活疫苗的免疫效力分析

H9亚型禽流感在我国家禽中广泛流行,给养禽业造成巨大经济损失的同时,也严重威胁着公共卫生安全。H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)具有高度遗传变异性,导致流行株和疫苗株之间抗原匹配性差,从而影响疫苗的临床保护效果,急需研发一种高效、具有交叉保护性的通用型H9亚型禽流感疫苗。马赛克疫苗是针对遗传多样性病原体设计,通过整合所有抗原序列获得一条抗原表位覆盖最广泛的嵌合蛋白,并制备疫苗。本研究参考mosaic疫苗设计原则,设计、优化并合成了一条H9亚型禽流感病毒的mosaic血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列,采用反向遗传操作技术,以H1N1亚型流感病毒PR8株为骨架,以mosaic H9 HA序列替换PR8株的HA片段,获得重组病毒rPR8-HAm/H9。将其制备为灭活疫苗并免疫SPF雏鸡,监测抗体水平、攻毒保护效果,评价其交叉保护效果。结果表明,重组病毒rPR8-HAm/H9灭活疫苗免疫SPF雏鸡,可诱导机体产生较高水平的HI抗体和中和抗体,可显著抑制攻毒后病毒的脱落,对H9N2 AIV JM0305株的攻毒保护率为80%。rPR8-HAm/H9灭活疫苗可以对异源H9N2 AIV JM0305株产生较好的交叉攻毒保护,为研发基于马赛克技术的禽流感通用疫苗提供了前期基础。

湖北地区鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了分离鉴定病鸡排泄物中的禽流感病毒,并分析其遗传背景,通过鸡胚接种试验区和病毒特异性抗体中和试验区,从病鸡排泄物中分离鉴定出2株禽流感病毒,分别命名为A/chicken/Jinmen/JM0305/2017(JM0305)和A/chicken/Daye/DY0602/2017(DY0602)。利用禽流感病毒亚型特异性抗体中和试验区和基因测序分析等方法对2株禽流感病毒进行亚型鉴定。结果表明,2株禽流感病毒均属于H9N2亚型。为了解这2株H9N2亚型禽流感病毒的生物学特性,对其全基因组进行了分析以及毒力测定。结果显示,将2株毒株感染雏鸡后,未产生明显的禽流感临床症状,2株H9亚型禽流感病毒的MDT值分别为72.0h和91.2h,HA裂解位点处的氨基酸序列均为-PSRSSR/GL-,表明2株禽流感病毒均属于低致病性禽流感。遗传进化分析表明2株病毒的HA基因均在H9亚型分支上,NA基因均在N2亚型的分支上;通过进化树分析表明2株病毒属于以A/chicken/Beijing/1/94(H9N2)为代表的欧亚谱系。该结果为进一步研究鸡源H9N2亚型禽流感病毒分子进化奠定了基础。

鸡胚免疫疫苗的研究现状及展望

鸡胚免疫技术是指对孵化后期的鸡胚接种活疫苗,使雏鸡出壳时,或出壳几天内就可获得主动免疫力。与传统免疫方式相比,鸡胚免疫具有填补免疫空白期、免疫效果均一确实、高通量自动化接种、节省人力成本等优点。目前,鸡胚免疫的最适接种日龄和接种方式为对18日龄鸡胚采用羊膜腔途径接种。鸡胚免疫技术已经在30多个国家得到应用,在美国已有80%肉鸡采用鸡胚免疫预防马立克氏病。除马立克氏病和鸡传染性法氏囊疫苗外,其余禽病的鸡胚接种疫苗尚处研发阶段。本研究论述了影响鸡胚接种的因素、鸡胚免疫的优缺点及国内外鸡胚疫苗的研发进展等,展示了鸡胚免疫疫苗的良好应用前景。

低致病性与高致病性H7N9亚型禽流感病毒分子特征及受体结合能力分析

对2017年从鸡病料中分离到的2株H7N9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)A/chicken/Hubei/093/2017(H7N9)和A/chicken/Hubei/207/2017(H7N9)(CK93和CK207)进行了全基因组测序。对血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)序列保守性、HA糖基化位点、NA耐药位点和6个内部基因的关键氨基酸位点进行了分析,同时测定了2株毒株的受体结合能力。结果显示,CK93毒株HA裂解位点为PEIPKGR↓GLF,为低致病性AIV特征;而CK207毒株裂解位点为PKP⁃KRTAR↓GLF,为高致病性AIV特征。HA第226位氨基酸在CK93毒株为亮氨酸(226L),而在CK207毒株为谷氨酰胺(226Q)。但受体结合能力测定发现,CK93和CK207都具有结合α-2,3唾液酸受体和α-2,6唾液酸受体的特性,说明Q226L并非影响病毒受体结合特性的决定性因素。本研究结果提示应加强对H7N9亚型禽流感病毒变异监测预防其突变可能造成流行的风险。

新城疫病毒TS09-C耐热株灭活疫苗研究

选用β丙内酯对新城疫病毒TS09-C耐热株进行灭活处理,探索该毒株的最适灭活条件,并对灭活后病毒的耐热特性和保存期进行检测,同时制备油乳剂灭活疫苗接种2周龄健康SPF鸡,免疫后14d检测其新城疫抗体水平。结果显示,经0.25g/Lβ丙内酯37℃灭活2h,可彻底灭活TS09-C株,同时可保证其良好的HA血凝效价和耐热特性,灭活后的TS09-C株在42℃条件下保存60d,其HA效价未见显著下降,而灭活的La Sota非耐热株已经降为0。TS09-C株和La Sota株利用同样方法制备的油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡后产生的新城疫抗体水平分别为27.3和26.7。该研究为研发抗原稳定性强的新城疫灭活疫苗打下了良好的前期基础。