采用不同的免疫抑制方法诱发大鼠卡氏肺孢子虫感染的研究

卡氏肺孢子虫肺炎是一种常见的机会感染,多见于免疫缺陷及免疫抑制患者。为进一步研究卡氏肺孢子虫生物学特性,我们采用给大鼠大剂量免疫抑制剂、■Co 辐照及幼大鼠胸腺切除三种不同的免疫抑制方法成功地诱发大鼠卡氏肺孢子虫显性感染。

红细胞感染恶性疟原虫后游离钙浓度变化的研究

采用活细胞钙离子荧光指示剂Fluo-3负载感染恶性疟原虫（FecI株）红细胞及正常红细胞，经流式细胞仪测定，根据荧光强度不同表示红细胞内游离钙浓度的变化。结果表明，感染红细胞内游离钙浓度分别为正常红细胞的1．83和2.99倍，呈明显增高。

复式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫的研究

目的： 建立在同一次扩增中即可鉴别患者感染的疟原虫虫种的复式ＰＣＲ检测方法。方法： 根据恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）中度重复基因序列ｐＢＲＫ１－１４ 和间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）线粒体细胞色素Ｃ氧化酶基因ＣＯＩＩＩ合成引物，采用经优化的ＰＣＲ反应体系， 对疟原虫ＤＮＡ模板进行扩增。结果： Ｐ．ｆ．与Ｐ．ｖ．分别被扩增出２０６ 和３７０ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段，与人白细胞ＤＮＡ 无交叉；用该反应体系至少可检测出原虫血症为５×１０－ ７的Ｐ．ｆ．感染和１．０２×１０－ ６ Ｐ．ｖ．感染； 自云南疟疾流行区采集的７８３份滤纸干血滴样本中， 复式ＰＣＲ法阳性检出率为８５．８％ ， 误诊率为０， 漏诊率为０．１％ ， 而镜检法依次分别为８４．９％ 、３．１％ 和１．０％ ， 两者符合率为９５．８％ 。结论： 本复式ＰＣＲ检测疟原虫较镜检敏感、特异， 适用于我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断、流行病学调查、药物的疗效考核和献血员的筛选等。

卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型的比较研究

目的 比较用SpragueDawley(SD)大鼠和Wistar大鼠建立卡氏肺孢子虫肺炎 (PCP)模型的差异。 方法 选用SD大鼠和Wistar大鼠 ,随机分为实验组和对照组 ,免疫抑制诱导建立动物模型 ;收集肺组织和支气管肺泡灌洗液 (BALF) ,分别制成肺印片和BALF涂片 ,作Giemsa染色 ,镜检卡氏肺孢子虫滋养体和包囊。结果 共收集实验组SD大鼠和Wistar大鼠的肺组织及BALF标本各 2 8份 ,经Giemsa染色后 ,在肺印片中查见Pneumocystiscarinii(Pc)虫体的阳性率分别为 89.2 9%和10 0 % ,两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;BALF阳性率分别为 6 0 .71%和 78.5 7% ,两者之间亦无显著性差异 (P >0 .0 5 )。而同种大鼠的肺印片与BALF涂片 ,其阳性率之间有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,且肺印片的检出率均显著高于BALF涂片。同种大鼠不同肺叶的肺印片 ,其阳性率之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。

PCR检测大鼠卡氏肺孢子虫的研究

目的探讨PCR技术检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值。方法SD大鼠和Wistar大鼠均随机分成实验组和对照组,实验组每周两次皮下注射醋酸可的松,诱导产生卡氏肺孢子虫;8week后,收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF),用PCR技术检测卡氏肺孢子虫DNA,并与Giemsa染色法比较。结果实验组两种大鼠肺组织卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为9643%和100%,BALF阳性率亦分别为9643%和100%,它们之间均无显著性差异(P>005);BALF的PCR阳性检出率显著高于Giemsa病原染色法,肺组织的两种方法检出率无显著性差异。结论PCR是一种检出率较高的方法,可作为早期诊断PCP的常规方法,特别适用于BALF检测卡氏肺孢子虫DNA。

IL-12联合IL-2在伯氏疟原虫红内期感染中的免疫调节作用

目的探讨IL-12联合IL-2在抗P.berghei红内期感染中的免疫调节作用。方法BALB/c小鼠接种5×105个感染P.berghei的RBC,同时分别给予0.03μg/dIL-12、40U/dIL-2或IL-12联合IL-2处理,连续用药6d,观察小鼠原虫血症变化及存活时间。通过淋巴细胞增殖转化试验、T淋巴细胞亚群测定及NK细胞杀伤活性检测等方法,观察细胞免疫应答水平。结果IL-12联合IL-2处理组可较单独IL-12或单独IL-2及感染对照组显著推迟原虫血症达峰值的时间与明显延长小鼠的存活时间,IL-12或联合IL-2组小鼠在原虫血症达30%时开始死亡,而单独IL-2或感染对照组小鼠在原虫血症低于13%时已全部死亡。IL-12联合IL-2处理组脾淋巴细胞总数、CD4+与CD8+百分比、3H-TdR掺入量及NK细胞杀伤活性均较其它各处理组及感染对照组显著升高。结论IL-12与IL-2二者可协同促进脾淋巴细胞的增殖及增强NK细胞杀伤活性以诱导抗P.berghei红内期感染的免疫保护作用。

聚合酶链反应用于鉴别恶性疟原虫不同分离株的研究

用恶性疟原虫主要裂殖子表面抗原基因序列（ＭＳＡ－１）为引物的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测恶性疟原虫感染。用此方法扩增实验室体外培养的ＦＣＣ１／ＨＮ株恶性疟原虫，显示１条３００ｂｐ的ＤＮＡ片断，而对实验室培养的巴布亚新几内亚ＦＣＱ－２７株则显示１条４４０ｂｐＤＮＡ条带。用此方法检测１５份采自云南中缅边界的恶性疟血样均能扩增出ＤＮＡ条带，但不同血样的ＤＮＡ条带的分子量不同，部分血样还存在１条以上的ＤＮＡ条带。在同时扩增的１０份正常人血样和１０份采自江苏间日疟流行区的现症间日疟血样中均没有发现ＤＮＡ条带。表明此方法具有很高的种和株的特异性。

IL-12在抗伯氏疟原虫感染中的免疫佐剂作用

目的 探讨IL - 12在抗伯氏疟原虫感染中的免疫佐剂作用。方法 BALB/c小鼠分别皮下用抗原sAg、IL - 12、抗原sAg联合IL - 12或抗原sAg联合弗氏佐剂进行免疫 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2wk ,末次免疫后 1wk以 5× 10 5个感染P berghei的RBC攻击感染 ,观察各组小鼠原虫血症变化及存活时间。攻击感染后 1wk收集各组小鼠血清 ,采用ELISA检测血清中IFN -γ、IL - 4、IL - 10及IgG水平。结果 抗原sAg联合IL - 12免疫可较其它各免疫组及未免疫对照组显著延长小鼠存活时间 ,且全部小鼠在原虫血症达 5 0 %时开始死亡 ;而单独抗原sAg、单独IL - 12或抗原sAg联合弗氏佐剂免疫与未免疫比较 ,对小鼠原虫血症及存活时间均无明显影响 ,且半数以上小鼠均在原虫血症小于 2 5 %时死亡。抗原联合IL - 12免疫组小鼠血清中IFN -γ及IgG水平较单独抗原sAg、单独IL - 12及未免疫组显著升高。 结论 结果表明 ,IL - 12与sAg抗原共同免疫小鼠可诱导对P berghei攻击感染的部分抵抗力 ,具有一定的免疫佐剂活性。

白细胞介素12在伯氏疟原虫红细胞内期感染中的免疫调节作用

[目的 ]探讨白细胞介素 12 (IL 12 )在伯氏疟原虫 (P berghei)红细胞内期感染中的免疫调节作用。[方法 ]BALB/c小鼠接种 5× 10 5个感染P berghei的RBC ,分别以不同剂量 ( 0 0 1、0 0 3、0 10和 0 15 μg/d)IL 12 ,或分别在不同给药时间 (感染前 1d、感染同时、感染后第 3d)给予 0 0 3 μg/dIL 12 ,各组均连续用药 6d。观察各组小鼠原虫血症变化及存活时间。[结果 ]与对照组比较 ,较低剂量 ( 0 0 1或 0 0 3 μg/d)IL 12均可显著推迟血中原虫的出现及原虫血症达峰值的时间 ,但仅 0 0 3 μg/d剂量可明显提高生存率 ;较惯剂量 ( 0 1或 0 15 μg/d)IL 12则增加原虫密度 ,加速小鼠死亡。在感染的第 3d给予 0 0 3 μg/dIL 12 ,对原虫血症、生存率均无明显影响。IL 12不能改变感染的结局 ,最终各组小鼠均死亡。[结论 ]IL 12具有免疫保护和毒副反应双重活性。诱导保护作用而减少毒副作用 ,剂量及给药时间是关键 ,适时地给予适当剂量的IL 12可诱导抗红内期疟原虫的部分保护作用。

IL-12对伯氏疟原虫红内期感染小鼠Th1/Th2细胞因子表达水平的影响

目的 观察白细胞介素 12 (IL - 12 )对伯氏疟原虫 (P.b)红内期感染小鼠 Th1/ Th2细胞因子表达水平的影响 ,探讨 IL- 12介导 Th1/ Th2免疫偏移在抗 P.b红内期感染中的免疫调节作用。方法 BAL B/ c小鼠接种 5× 10 5个感染 P.b的红细胞 ,同时分别给予 0 .0 3μg/ d或 0 .15 μg/ d IL- 12处理 ,用 EL ISA方法检测 P.b感染小鼠血清或脾淋巴细胞体外培养上清中细胞因子 IFN-γ、IL - 4表达水平的动态变化。结果 0 .0 3μg/ d IL - 12处理组小鼠接种感染后第 7天取脾淋巴细胞体外经PHA或可溶性抗原 s Ag刺激培养产生的 IFN- γ水平较感染对照组显著升高 ,IL- 4水平显著下降 ,而 0 .15 μg/ d IL- 12处理组脾淋巴细胞产生的 IFN- γ及 IL- 4水平均较感染对照组显著下降。在感染后第 3天 ,0 .0 3μg/ d或 0 .15μg/ d IL - 12处理组小鼠血清中 IFN-γ均已出现 ,第 5天达高峰 ,但感染后第 7天 0 .15 μg/ d IL- 12处理组血清中 IFN- γ迅速下降 ,甚至低于感染对照组及 0 .0 3μg/ d IL- 12处理组 ,感染对照组直到感染后第 7天血清中方可检测到 IFN- γ水平。结论 适当低剂量 IL- 12诱导 CD4 + Th1免疫应答 ,产生细胞因子 IFN-γ,以诱导抗 P.b红内期感染的免疫保护作用 ;而较大剂量 IL - 12抑制机体抗感染?

IL-12对伯氏疟原虫红内期感染小鼠淋巴细胞增殖活性的影响

目的探讨IL12对伯氏疟原虫(P.b)红内期感染小鼠淋巴细胞增殖活性的影响。方法每只BALB/c小鼠接种5×105个感染P.b的RBC,同时每天分别给予0.03或0.15μgIL12处理,用3HTdR掺入法检测脾淋巴细胞增殖转化活性,流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群CD4+与CD8+百分比。结果每天给予0.03或0.15μgIL12处理,均可显著增加P.b感染小鼠脾淋巴细胞数量及CD4+、CD8+数。每天给予0.03μgIL12可显著促进脾淋巴细胞的增殖转化,而每天给予0.15μgIL12则明显抑制脾淋巴细胞增殖。结论适当低剂量IL12可促进P.b感染小鼠脾淋巴细胞增殖活性,增强机体抗感染免疫,而较大剂量IL12则抑制脾淋巴细胞增殖活性,甚至可致免疫病理损害。

聚合酶链反应检测恶性疟原虫的研究

通过５ 对根据恶性疟原虫不同基因序列设计的引物筛选及７ 种从滤纸干血滴中快速制备疟原虫ＤＮＡ模板的方法的比较，以建立一种敏感、特异、简便、快速的聚合酶链反应（ＰＣＲ） 检测恶性疟原虫的方法。结果表明，根据恶性疟原虫中度重复基因序列ｐＢＲＫ１１４ 设计的引物，可从恶性疟原虫ＤＮＡ 中扩增出２０６ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段，而间日疟原虫、人白细胞ＤＮＡ均无此扩增带出现，并至少可检测出原虫血症为５ ×１０－ ７ 的感染水平，且适用于我国不同地理株恶性疟原虫的检测；滤纸干血滴样本经生理盐水溶血煮沸法处理的ＰＣＲ 扩增效果最为理想，且简易、经济、重复性好；在云南疟疾流行区采集的３６０ 份血样中，ＰＣＲ 法与镜检法符合率为９７ ．５％ 。本研究建立的ＰＣＲ 检测恶性疟原虫方法具有敏感、特异、简易和快速的特点，便于现场推广应用。

烟酸诱激人体恶性疟原虫的研究

本研究应用烟酸诱激人体恶性疟原虫,提高了血液涂片中的原虫数和阳性检出率。对34例恶性疟原虫阳性患者分别于服烟酸前和服烟酸后15、30、60、120和180min 耳垂采血检查,作原虫计数,服烟酸后分别比服烟酸前增加8.0%、26.6%、68.6%、68.1%和48.0%。镜检阴性的48例疑似病人,经诱激后转为阳性的11例。仍为阴性的37例,经随访15d,均未有临床发作,血检仍为阴性。普查581人,服烟酸后阳性检出率比未服烟酸前多检出14例,阳性检出率提高24%。适宜的烟酸剂量成人为200mg,服后60min 左右时采血为宜。

NO在IL-12诱导抗伯氏疟原虫感染免疫效应中的作用

目的 探讨NO在IL 12诱导抗伯氏疟原虫 (P .b)感染免疫效应中的作用。 方法 每只BALB/c小鼠接种 5× 10 5个感染P .b的RBC ,分组后分别给予 5mg/dNO合成酶选择性抑制aminoguanidine、0 .0 3 μg/dIL 12和aminoguani dine联合IL 12处理。观察各组小鼠原虫血症变化及生存时间。感染第 5d收集小鼠血清进行NO水平测定。 结果 aminoguanidine联合IL 12处理组小鼠的原虫血症水平与单独IL 12组差异不明显 ,却使小鼠生存率显著降低 ;IL 12联合aminoguanidine处理组较单独aminoguanidine及感染对照组原虫血症达峰值的时间显著推迟 ,小鼠存活时间明显延长。IL 12处理小鼠血清NO水平显著上升 ;给予aminoguanidine后的小鼠血清NO含量较低 ,与感染对照组水平接近。 结论 aminoguanidine能有效的抑制IL 12诱导的NO的产生 ,显著降低IL 12处理小鼠生存率 ,但对原虫血症水平无明显影响。因此 ,IL 12抗P .b感染的免疫保护作用部分依赖NO介导 ,且NO的作用可能并非是NO对疟原虫的直接杀伤。