山奈酚通过Wnt/β-catenin信号通路调节骨细胞合成代谢进而改善骨质疏松的作用机制

目的在细胞水平探讨山奈酚对成骨细胞的促进作用及对信号通路蛋白Wnt/β-catenin表达的影响。方法复苏与培养小鼠原成骨细胞MC3T3-E1 Subclone14,用不同浓度(1、2、5、10、20、50 mmol/L)的山奈酚处理细胞不同时间(24、48、72 h),利用细胞计数试剂(CCK-8)测定细胞活力,筛选山奈酚最适处理浓度及处理时间。将探究山奈酚促进成骨的相关检测的实验分为对照组与山奈酚组,对照组细胞进行正常培养,山奈酚组细胞用10 mmol/L山奈酚处理24 h;分别利用碱性磷酸酶(ALP)与前列腺素(PG)E2酶联免疫试剂盒、一氧化氮(NO)生化检测试剂盒对细胞内ALP、PGE2与NO含量进行测定;利用Western印迹检测细胞内骨保护蛋白(OPG),核转录因子配体受体激活体(RANKL)及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平。Wnt/β-catenin信号通路介导山奈酚作用的实验分为对照组、山奈酚组、MSAB组、MSAB+山奈酚组,对照组细胞进行正常培养,山奈酚组细胞用10 mmol/L山奈酚处理24 h,MSAB组细胞用5 mmol/L MSAB处理24 h,MSAB+山奈酚组用5 mmol/L MSAB与10 mmol/L山奈酚共同处理24 h,利用CCK8检测各组细胞活力;利用Western印迹检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达情况。结果山奈酚最适处理浓度为10 mmol/L,最佳处理时间为24 h。与对照组相比,山奈酚组细胞中ALP含量显著升高(P<0.05),而细胞中PGE2、NO含量显著降低(P<0.05),细胞中OPG蛋白、Wnt1蛋白与p-β-catenin蛋白表达水平显著升高(P<0.05),RANKL蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与山奈酚组相比,MSAB组细胞抑制率显著升高(P<0.05);与MSAB组相比,MSAB+山奈酚组细胞抑制率显著降低(P<0.05);与对照组相比,山奈酚组细胞内Wnt1蛋白与p-β-catenin蛋白表达水平显著升高(P<0.05),MSAB组细胞内Wnt1蛋白与p-β-catenin蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与MSAB组相比,MSAB+山奈酚组内细胞Wnt1蛋白与p-β-catenin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论山奈酚可以增加小鼠原成骨细胞的活力、增殖作用,通过Wnt/β-catenin信号通路发挥促进成骨的作用,可能是其防治骨质疏松的机制。

青娥方对骨质疏松骨关节炎模型鼠早期软骨下骨基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白表达的影响

目的:探讨中药复方青娥方对骨质疏松骨关节炎模型鼠早期软骨下骨组织形态以及基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白表达的影响。方法:30只大鼠随机分为正常组(A组)、青娥方组(B组)、骨质疏松模型(C组)、骨质疏松骨关节炎模型(D组)和骨关节炎模型(E组),每组6只。其中B,C和D组进行骨质疏松模型制备,1个月后B,D和E组进行骨关节炎造模,接着术后第2天,B组灌服青娥方药液,其余各组灌服等量的生理盐水,1次/d,连续4周。结果:病理切片可见D组的各个时期均可见软骨下骨板逐渐增厚,软骨细胞四层结构不易分辨,可见双重潮线。软骨下骨板逐渐断裂至钙化软骨层内,软骨下骨骨小梁逐步紊乱、稀疏、断裂。B组干预后第1周软骨下骨板部分碎裂,潮标线不清晰,干预后第2周潮标线部分显示,可见少量增生血管。干预后第4周可观察到潮线结构基本完整,软骨下骨板下方的骨小梁结构欠规则,内可见增生的血管。软骨下骨骨组织在中药复方干预后第4周时各组软骨下骨骨小梁体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离度和骨小梁厚度(Tb.Th)与A组差异无统计学意义(P>0.05),与D组差异有统计学意义(P<0.05)。胫骨髁骨组织中正常组MMP3和OPN基因维持在相对稳定的水平;B组MMP3和OPN基因上调表达维持在相对稳定的水平;与D组相比,B组MMP3和OPN在治疗后第2周和第4周差异有统计学意义(P<0.05)。结论:中药青娥方可以改变关节软骨和软骨下骨镜下表现,调节软骨下骨组织骨小梁各项指标以及MMP3和OPN表达水平,改善骨代谢,延缓早期软骨下骨骨丢失,防治骨质疏松骨性关节炎。

青娥方对膝骨关节炎伴骨质疏松模型大鼠早期软骨下骨整合素及抑癌基因表达的影响

目的:观察青娥方药液对膝骨关节炎伴骨质疏松模型大鼠软骨下骨中整合素αvβ3及P53基因表达的影响。方法:将30只SD大鼠编号后,随机分为正常组(A组)、青娥方组(B组)、骨质疏松组(C组)、骨关节炎伴骨质疏松组(D组)和骨关节炎组(E组),每组6只。将B组、C组和D组大鼠腹腔注射麻醉后,行骨质疏松造模。1个月后,再将B组、D组、E组三组大鼠麻醉后行骨关节炎造模,术后行相同处理。经二次造模1d后,B组大鼠持续4周每天灌服1次药液。其余各组大鼠以相同剂量每天灌服1次生理盐水。结果:正常组整合素αvβ3基因在第2,4周均呈弱上调表达,表达水平维持相对稳定;B组整合素αvβ3基因表达随着时间的推移先呈现出较A组增高的水平,但逐渐出现下降趋势;B组整合素αvβ3及P53基因水平表达相对稳定,趋近A组;相较于D组,B组大鼠经青娥方治疗后,其胫骨髁软骨下骨组织中的整合素αvβ3基因表达水平在第2,4周的差异有统计学意义(P<0.05)。C组、D组、E组三个时间点P53基因均呈弱上调表达,随着时间的推移,P53表达水平小幅度上升;B组P53基因表达水平与A组差异无统计学意义(P>0.05),且低于同时期其他三组。结论:青娥方能够抑制整合素αvβ3在软骨下骨组织中的表达,从而降低破骨细胞活性,减少骨吸收,有利于促进骨吸收、骨形成平衡的恢复,而对P53基因表达的抑制作用尚不明显。