用人肝细胞cDNA文库制备Dig-Fas探针

为探索SLE发生、发展与Fas表达的关系 ,本文采用降落PCR技术、分子克隆技术和Fas特异性引物 ,将从人肝细胞cDNA文库中扩增的FascDNA插入T -easyvector中 ,转染JM10 9,经耐药性和lacZ插入失活筛选 ,快速细胞裂解法、限制性内切酶酶切片段和PCR扩增试验分析鉴定 ,确证获阳性转化子。然后采用地高辛化学连接标记和查见方法 ,标记扩增、分离和纯化的FascDNA ,经斑点免疫实验证实获高滴度Dig

PCR 影响因素初探(二) 模板 DNA 质量对 PCR 结果的影响

本文探索了模板ＤＮＡ浓度和质量对ＰＣＲ扩增结果的影响。结果表明模板ＤＮＡ的质和量，特别是其中待扩增的目的基因原始拷贝数量是影响ＰＣＲ反应结果的重要因素。用较高浓度，较完整长度及不含或少含蛋白成分的核酸作模板，并使用更敏感的方法检测ＰＣＲ产物，可避免假阴性反应和提高ＰＣＲ技术的敏感性和特异性。同时，实验结果还证实用新鲜或液氮冻存组织ＤＮＡ作模板，优于石蜡包埋组织。

基因组免疫系统

随着对RNAi现象及其功能的深入研究 ,揭示dsRNA/siRNA具靶向降解特异性mRNA、抑制相应基因表达作用 ,有抵抗病毒和转座子入侵基因组的重要功能 ,故被称为“基因组免疫系统”。本文综述了该系统的发现、功能、作用机制和应用前景。

PCR影响因素初探（一）Mg^（＋＋），dNTP等对PCR扩增结果的影响及控制方法

为进一步提高聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的特异性和敏感性，本文探索了ＰＣＲ反应体系中ＤＮＴＰ，Ｍｇ~，引物及Ｔａｑ酶等对ＤＮＡ扩增结果的影响及控制方法。结果表明上述因素对扩增结只有重要影响作用。通过实验确定上述成分的最佳浓度及采用ＤＮＡ杂支技术或序列测定技术检测ＰＣＲ产物，不仅将有助于进一步提高此反应的特异性和敏感性，而且亦将有助于扩大ＰＣＲ技术的应用范围。

加强管理深化教学改革努力培养具创新能力的医学人才

为培养合格人才 ,本部多年来一直围绕“如何提高教学质量 ,培养合格人才”这一教学中的永恒主题 ,做了以下几方面的工作。 (1)采取多种措施 ,狠抓师资培养工作 ,既拓宽了教师知识面 ,提高了教师学术水平和全面素质 ,又为提高教师综合能力 ,更新教学内容和教学手段奠定了基础。 (2 )加强教学各环节管理 ,坚持定期教学检查 ,严格质量监控 ,使教学质量得到稳步提高。 (3)认真开展教学改革 ,为发展学生的创新能力奠定了基础。

用bcl-2反义mRNA和dsRNA抑制SP_2/O生长的比较研究

目的 本研究旨在比较靶向bcl- 2基因的反义mRNA和dsRNA对SP2 O细胞生长的抑制作用。方法 采用MTT法,免疫荧光和免疫细胞化学技术,克隆形成试验及分光光度计测定细胞总蛋白含量等方法,分析比较了经体外转录获得的bcl- 2反义mRNA利LdsRNA抑制SP2 O细胞生长、bcl- 2特异性蛋白和总蛋白表达及其克隆原性的作用。结果 检测结果证实bcl- 2反义mRNA和dsRNA对上述指标均有抑制作用,两者比较dsRNA的抑制作用更强,持续时间也较长,作为对照的bcl- 2正义RNA对上述指标无显著增强作用。提示LdsRNA对bcl- 2高表达的肿瘤细胞有更强的抑制和杀伤作用,因此有可能用于这些肿瘤的临床治疗。

一种激活B95—8细胞增加EBV抗原表达的新方法

为获取良好的免疫原,以制备抗EBV的单克隆抗体,本文研究了用H_2O_2诱导B95—8细胞增加EBV抗原表达的实验方法及结果。实验证实用0.2 mMH_2O_2与B95—8细胞作用30分钟,再培养5天,可诱导大量EBV抗原合成。对所得结果进行统计学处理表明经H_2O_2激活的B95—8细胞,EBV抗原阳性细胞的百分率非常显著地高于未经H_20O_2处理的B95—8细胞(P<0.001)。该结果提示经H_2O_2激活的B95—8细胞可作为一种良好的免疫原,用于诊断NPC或制备抗EBV的特异性抗体。同时,鉴于H_2O_2能诱导EBV基因合成EBV抗原,而这些抗原一旦合成,瘤细胞即死亡,故H_2O_2亦可用于治疗NPC。

bcl-2与GM-CSF的LdsRNA对肿瘤细胞生长的抑制作用

目的 探索bcl-2-9GM-CSF的长链dsRNA(Longer doublestrand RNA，LdsRNA)对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法使用体外转录法制备地高辛标记的bcl一2和GM—CSF基因的LdsRNA，转染THP1、HL-60和K562髓系白血病细胞系，分别以MTT法、免疫组化、免疫荧光技术和紫外分光光度计检测细胞LdsRNA转染水平，细胞增殖，特异性bcl-2蛋白表达和细胞总蛋白含量。结果LdsRNA能显著抑制THP1细胞增殖(P<0．05)和蛋白质合成，对HL-60和K562细胞系也有一定的抑制作用。结论LdsRNA能抑制肿瘤细胞的增殖，为以后利用LdsRNA用于肿瘤的治疗奠定一定的理论基础。

用PTVS检测t（14；18）PCR产物的DNA序列

为确定聚合酶链反应（ＰＣＲ）和地高辛（ＤＩＧ）系统检测ｔ（１４；１８）的特异性，我们采用ＰＧＥＭ－Ｔｖｅｃｔｏｒ系统（ＰＴＶＳ）和双脱氧链终止技术克隆并测定了ＲＬ细胞系和一个ＮＨＬ患者－Ａｍｂｒｏｓｅｎ的ｔ（１４；１８）ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序列。结果表明两者的ＰＣＲ扩增产物均为ｂｃｌ－２－ＪＨ融合基因片段，证实ＰＣＲ－ＤＩＧ系统是一种特异的检测ｔ（１４；１８）的方法。同时还表明用ＰＴＶＳ对ＰＣＲ。产物进行克隆测序优于直接用双脱氧法测序。

黄芪总黄酮对辐射损伤小鼠的防护作用研究

目的:研究黄芪总黄酮(Total flavonoids of astragalus,TFA)对受60Coγ射线损伤小鼠的辐射防护作用,为TFA的临床应用提供实验依据。方法:采用大剂量60Coγ射线一次性全身照射雌性昆明小鼠,制成放射损伤动物模型。小鼠在照射前3d及照射后,以不同剂量的TFA连续灌胃14d,观察受致死剂量60Coγ射线照射小鼠的30d存活率及生存时间长短。同时,在低剂量照射组检测用药后小鼠体重、外周血指标、脾脏指数的变化。用HE染色观察脾脏的病理学改变。结果:TFA不仅能明显延长辐射损伤小鼠的平均存活天数,提高小鼠30d存活率(P<0.05);而且能显著降低辐射损伤小鼠外周血白细胞的下降幅度、缩短其恢复所需时间(P<0.05);同时,TFA还能促进小鼠脾重指数的恢复,减轻辐射对小鼠脾脏的损伤程度,促进造血灶增生,加快造血功能恢复。结论:TFA具有较强的抗辐射作用,能显著提高受致死剂量60Coγ射线照射小鼠的存活率,降低辐射对小鼠外周血WBC和PLT及脾脏的损伤作用,其具体作用机制有待进一步深入研究。

防风苍耳子水煎剂对小鼠免疫功能的影响

本文用ＥＬＩＳＡ法研究了防风、苍耳子水煎剂对ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ的调节作用。结果表明：防风和苍耳子水煎剂均能显著抑制ＤＮＰ－ＢＳＡ致敏小鼠的ＩｇＥ产生（Ｐ＜００５），延迟和减轻卵蛋白致敏豚鼠的Ｉ型超敏反应。其中防风对ＩｇＧ和ＩｇＭ抗体的产生、以及细胞免疫功能都有显著的增强作用（Ｐ＜００５和＜００１），苍耳子对体液免疫作用不明显（Ｐ＞００５），但对细胞免疫却有抑制作用（Ｐ＜００１和＜００５）。

猪苓多糖对脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建的调节效应

目的:人脐血造血干细胞得以移植于小鼠体内,其理论基础是放射线照射使小鼠骨髓枯竭,龛位腾出,为移植的脐血造血干细胞提供空间,而猪苓多糖是从中药猪苓中提取的多糖成分,具有免疫调节抗肿瘤作用,也是一种非T细胞促有丝分裂素,对放射线照射有一定的防护作用。观察猪苓多糖对脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建效应。方法:实验于2004-06/2006-05在兰州大学基础医学院免疫研究所完成。①实验材料:清洁级BALB/c小鼠由兰州生物制品研究所提供,8周龄,体质量约20g,雌雄各半,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。脐血样本由兰泰医院妇产科提供,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准。猪苓多糖由兰州大学第一医院提供。②实验方法:应用20,17.5,12.5,7.5mg/L猪苓多糖体外扩增培养脐血造血干细胞,并测定细胞增殖率及CD34+细胞数。将BALB/c小鼠分为正常对照组:尾静脉、腹腔注射等量生理盐水;照射空白组:3.5Gy经^(60)Coγ放射线照射联合尾静脉、腹腔注射等量生理盐水;照射药物组:3.5Gy经^(60)Coγ放射线照射联合尾静脉注射等量生理盐水、腹腔注射猪苓多糖;照射移植组(n=15):3.5Gy经^(60)Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射等量生理盐水;照射移植药物组:3.5Gy经^(60)Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射猪苓多糖。③实验评估:观察小鼠生存状况及血常规变化,流式细胞仪测定CD3、CD4、CD8、CD19水平。结果:57只小鼠均进入结果分析。①12.5mg/L猪苓多糖增殖效率最为显著(P<0.01),流式细胞仪测定显示CD34+细胞数扩增了6.33倍。移植药物组小鼠死亡率最低,死亡高峰集中在照射移植后7~14d左右。②移植药物组小鼠血象恢复正常,并且时间明显短于其他实验组(P<0.05)。③细胞及体液免疫恢复情况,移植药物组小鼠各项指标水平与正常小鼠无差别(P>0.05),与其他各组小鼠比较,除CD4、CD19水平与照射移植小鼠无差别外均有差别(P<0.05)。结论:猪苓多糖对脐血造血干细胞有明显扩增作用,并能促进脐血造血干细胞移植小鼠免疫造血重建。

南充地区不同叶型半夏的指纹图谱分析

目的:比较南充地区野生芍药叶型和竹叶型半夏的指纹图谱并鉴定差异分子。方法:采用RAPD扩增、分析不同叶型半夏指纹图谱,并对典型特异扩增条带进行克隆和测序分析。结果:36条随机引物中有22条扩增出清晰条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增出157条带,竹叶型半夏基因组DNA扩增出161条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增的差异带3条,竹叶型半夏基因组DNA扩增的差异带7条。差异条带AOPN-14300经克隆测序证实为非编码区序列,Genbank登记号为EF417577。结论:南充野生不同叶型半夏基因组存在差异,已将部分典型差异基因组DNA片段进行克隆,为从分子水平鉴别本地区半夏奠定基础。

半夏、水半夏RAPD分析及构建特异DNA探针

目的:建立鉴定半夏、水半夏的分子标记方法。方法:利用22条随机引物,对四川两种半夏、广西两种水半夏基因DNA进行RAPD扩增,并对其差异条带进行测序、标记构建探针和Southern杂交。结果:半夏、水半夏基因DNA之间扩增的差异条带较多。通过测序、标记构建探针和杂交确认一半夏特异的标记分子。结论:通过RAPD和构建特异DNA探针能准确鉴别半夏和水半夏。

紫外线致Hep-G2细胞调亡的分子机制初探

紫外线 (UV)是人类最常接触的具基因毒作用的因子。为探索紫外线辐射致细胞凋亡和组织损伤的分子机制 ,本研究采用免疫细胞化学技术与特异性抗体初步探索了经紫外线辐射处理的Hep G2细胞P5 3、Caspase3、bcl 2和P2 1等与细胞凋亡和生长抑制基因的表达情况。结果表明经紫外线辐射处理的Hep G2细胞的P5 3、Caspase3和bcl 2基因表达增加 ,而P2 1未见明显改变 ,提示P5 3、Caspase基因在紫外线辐射诱导的细胞凋亡中起重要作用 ,bcl 2增高可能有抑制细胞的过度凋亡 ,保持内在平衡的作用。P2 1保持不变或下降可能反映了细胞对DNA损伤应答的新途径。

浅谈计算机多媒体技术在微生物及免疫学教学中的应用

为了能够更好利用计算机多媒体技术,使其在微生物与免疫学教学中发挥积极的作用,本文就利用计算机多媒体技术在医学教学实践中的运用经验进行探索和总结。

RNA干扰体外抑制HBeAg的表达

目的:构建乙型肝炎病毒前C/C基因小发夹RNA(shRNA)表达载体,探索shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制作用。方法:用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切、测序鉴定后,与HBeAg表达载体pcDNA3.1preC/C按7∶1的比例,共转染HeLa细胞,采用半定量PCR和微粒子酶免疫试验(MEIA)分析shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制情况。结果:经限制性内切酶、测序证实成功构建shRNA表达载体;筛选到psiHBV2载体对HBeAg表达有一定抑制作用,对mRNA的抑制率为75%,对蛋白质的抑制率为53%,其余两序列无明显抑制作用。结论:RNAi技术可以有效抑制载体pcDNA3.1preC/C表达HBeAg。

RNA干扰体外抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的针对乙型肝炎病毒(HBV)prec/c区构建shRNA表达载体,观察shRNA表达载体对HBV抗原表达的抑制作用,为运用RNA干扰(RNAi)技术治疗乙型肝炎奠定基础。方法运用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切,测序鉴定确认后,与1.5倍HBV真核表达质粒pHBV1.5共转染Hela细胞,并于转染后72 h,用微粒子酶免疫实验(MEIA)分别检测细胞上清液和细胞裂解液中HBsAg和HBeAg表达水平;用半定量PCR检测prec/c mRNA的转录情况;分析shRNA表达载体对HBe/HBs抗原表达的抑制情况。结果成功构建了针对HBV prec/c区的shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6及无关shRNA表达载体psiC;筛选到对HBeAg有明显的抑制作用的psiHBV4载体,同时其对HBsAg的表达有促进作用;psiHBV5和psiHBV6对HBeAg的抑制作用相对较弱,其对HBsAg的表达也有不同程度的促进作用;无关干扰对照psiC对HBV两种抗原的表达均无显著抑制作用。结论成功构建带U6启动子的shRNA表达载体并初步筛选到可显著抑制HBeAg表达的psiHBV4;本研究设计的3个靶向序列中,只有一个序列有大约70%的抑制率,而另外两个序列的抑制率相对较小,说明RNA干扰作用有较强的序列依赖性;无关干扰序列psiC几乎无干扰作用,说明siRNA产生的干扰作用具有高度的特异性。以上结果为应用RNAi治疗乙型肝炎奠定了一定的基础。

南充野生半夏遗传关系RAPD分析

目的比较南充野生芍药叶型、竹叶型半夏的遗传关系。方法使用22条随机引物,对上述两种叶型半夏基因组DNA进行RAPD扩增,比较它们的差异条带。利用Nei,Li方法计算两种半夏之间的遗传相似系数和遗传距离指数。结果22条引物可对南充野生芍药叶型、竹叶型半夏扩增出清晰条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增出157条带,竹叶型半夏基因组DNA扩增出161条带,芍药叶型半夏基因组DNA扩增的差异带3条,竹叶型半夏基因组DNA扩增的差异带7条。它们的遗传相似系数为0.9686;遗传距离指数为0.0314。结论利用RAPD技术证实了野生芍药叶型、竹叶型半夏的遗传关系存在差异,为进一步利用该技术进行半夏分类鉴定等研究奠定了基础。

FTY720诱导1型1-磷酸鞘氨醇受体内化与其保守基序的关系研究

目的:研究FTY720诱导1型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1)内化与后者保守基序之间的关系。方法:以HA-S1P1(WT)-Myc-EGFP-N1融合表达载体为模板,应用重叠PCR的方法,将S1P1保守基序ERY突变为ENY,构建HA-S1P1(R142N)-Myc-EGFP-N1融合表达载体。测序鉴定后,经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。100 nmol/LFTY720处理3、6、12小时后,荧光显微镜下观察S1P1在HEK293细胞上的表达情况。结果:HA-S1P1(R142N)-Myc-EGFP-N1载体被成功构建,S1P1(WT)和S1P1(R142N)蛋白表达在HEK293稳定细胞株的表面,FTY720能诱导S1P1(WT)内化,但不能诱导S1P1(R142N)内化。结论:FTY720诱导S1P1内化与ERY保守基序有关。